魯大鵬 王保龍

肝細(xì)胞癌（ hepatocellular carcinoma，HCC）簡(jiǎn)稱肝癌，是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，手術(shù)切除、肝移植和射頻消融術(shù)是治療HCC的主要方法[1-3]。肝癌發(fā)病隱匿，早期癥狀一般不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已是晚期；其惡性程度高，根治性治療后患者的復(fù)發(fā)率仍然較高，其5年生存率僅為18%，是僅次于胰腺癌的第二大致死腫瘤[4-6]。尤其在中國(guó)，肝癌患者的前景更加嚴(yán)峻，5年生存率低至12%[7]。因此，

尋找和探索除甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP） 以外的肝癌早期診斷、療效觀察的腫瘤標(biāo)志物極為重要。miRNAs是一類含有19～22個(gè)核苷酸的小非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)[8]。大量研究表明，miRNAs廣泛參與肝癌的增殖、凋亡、遷移與侵襲、耐藥等發(fā)生發(fā)展過(guò)程，是肝癌早期診斷的重要指標(biāo)之一。近期報(bào)道顯示與肝良性病變相比，肝癌患者血清中的7種miRNAs（包括miR-21，miR-26a，miR-27a，miR-122，miR-192，miR-223，和miR-801）簡(jiǎn)稱miRNA7，表達(dá)水平均具有顯著的差異，調(diào)控肝癌細(xì)胞活性，對(duì)肝癌早期診斷有一定的指導(dǎo)作用，具有作為HCC早期診斷標(biāo)志物的潛力[9-13]。另外，研究表明聯(lián)合檢測(cè)血清中miR-21，miR-26a，miR-27a，miR-122，miR-192，miR-223，miR-801可以準(zhǔn)確地區(qū)分肝癌患者和健康人群，即使在AFP陰性肝癌患者中仍能較準(zhǔn)確地區(qū)分兩類人群[14]。因此，聯(lián)合檢測(cè)miRNA7對(duì)肝癌患者的早期診斷具有重要的臨床意義。

本研究對(duì)HCC患者血清中miRNA7、AFP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平進(jìn)行檢測(cè)，探討三者聯(lián)合檢測(cè)在肝癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

1 一般資料 收集2020年6月～2022年1月于中國(guó)科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)行診治的75例原發(fā)性肝癌患者（肝惡性組）、70例非癌性患者（肝良性組）、以及32例健康體檢者（對(duì)照組），進(jìn)行血清miRNA7、AFP、CEA含量檢測(cè)。肝惡性組中男性65例，女性10例；年齡24～79歲，平均（57.88±10.88）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：① HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（ 2017 年版） 》[15]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床診斷和病理診斷均經(jīng)影像學(xué)及病理組織學(xué)確診；③所有肝癌患者采血前均未進(jìn)行手術(shù)、放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在嚴(yán)重心血管疾病、精神疾病的患者; ②酒精性肝硬化；③伴其他部位腫瘤者;④近期服用影響檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果的藥物者。肝良性組包括20例肝炎，35例肝硬化，10例肝囊腫和5例肝血管瘤，其中男性52例，女性18例；年齡35～84歲，平均（56.44±1.74）歲。對(duì)照組為健康體檢者，其中男性26例，女性6例；年齡29～76歲，平均（52.8±11.1）歲。肝惡性組、良性組以及對(duì)照組性別、年齡相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2 方法 采集入選者空腹靜脈血4 mL，3 500 r/min轉(zhuǎn)速，離心10 min后收集上層血清，于-20 ℃ 冰箱凍存。PCR熒光探針?lè)y(cè)定血漿miRNA7的總相對(duì)定量值Logit（Logit =-1.944 9+0.106 33×dCtmiR-21+0.102 19×dCtmiR-26a-0.012 441×dCtmiR-27a-0.289 02×dCtmiR-122-0.327 79×dCtmiR-192+ 0.258 55×dCtmiR-223-0.029 515×dCtmiR-801），儀器為熒光定量PCR儀（ABI 7500型號(hào)），試劑為駿實(shí)生物公司提供，按其試劑盒步驟檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定血清腫瘤標(biāo)志物AFP、CEA含量，儀器為羅氏免疫分析儀Cobas 8000，試劑由羅氏公司提供。

3 評(píng)價(jià)指標(biāo) ①檢索miRNAs相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)ENCORI： The Encyclopedia of RNA Interactomes. （starbase.sysu.edu.cn/index.php），評(píng)估m(xù)iRNA7在肝癌組織中的表達(dá)水平；②檢測(cè)三組血清中miRNA7、AFP和CEA含量；③檢測(cè)三組血清中miRNA7、AFP和CEA陽(yáng)性率；④通過(guò)構(gòu)建入選者特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線 ，計(jì)算血清miRNA7、AFP和CEA單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷肝癌的曲線下面積（area under the curve，AUC） 。正常參考范圍：miRNA7＜-0.5，AFP≤7 ng/mL，CEA≤5 ng/mL。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。血清miRNA7、AFP和CEA水平為計(jì)量資料，采用（±s）表示，比較行t檢驗(yàn); 檢測(cè)陽(yáng)性率為計(jì)數(shù)資料，比較行χ2檢驗(yàn)，AUC值分析行Z檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miRNA7在肝組織中的表達(dá) MiRNAs相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)ENCORI包含了50例肝正常組織和370例肝癌組織的相關(guān)數(shù)據(jù)信息。檢索相關(guān)miRNA7數(shù)據(jù)顯示，相比于肝正常組織，肝癌組織中miR-21，miR-26a，miR-27a，miR-122， miR-192和miR-223均顯著異常表達(dá)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（miR-801相關(guān)研究較少，故數(shù)據(jù)庫(kù)未統(tǒng)計(jì)），見(jiàn)圖1。

圖1 ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA7在肝正常組織和HCC組織中的表達(dá)差異分析

2 三組血清miRNA7、AFP、CEA水平比較 分別檢測(cè)入院時(shí)三組患者血清miRNA7、AFP和CEA的表達(dá)水平，表2結(jié)果顯示肝惡性組織中miRNA7的總相對(duì)定量值Logit、AFP和CEA水平均顯著高于肝良性組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 三組血清miRNA7、AFP、CEA水平比較（±s）

表2 三組血清miRNA7、AFP、CEA水平比較（±s）

注：*P＜0.05。

3 三組血清miRNA7、AFP、CEA檢測(cè)陽(yáng)性率比較 肝惡性組血清miRNA7、AFP、CEA檢測(cè)陽(yáng)性率顯著高于肝良性組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

表3 三組血清miRNA7、AFP、CEA檢測(cè)陽(yáng)性率比較[n（%）]

4 血清miRNA7、AFP、CEA單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積（AUC）分析 構(gòu)建肝惡性組和對(duì)照組間的ROC曲線（見(jiàn)圖2A），血清miRNA7、AFP、CEA聯(lián)合檢測(cè)的AUC值為0.97，顯著高于三者單獨(dú)檢測(cè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表4）；同時(shí)，構(gòu)建肝惡性組和良性組間的ROC曲線（見(jiàn)圖2B），三者聯(lián)合檢測(cè)的AUC值為0.92，也顯著高于miRNA7、AFP、CEA單獨(dú)檢測(cè)，其與AFP、CEA間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但與miRNA7間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表5）。結(jié)果表明血清miRNA7與AFP、CEA聯(lián)合檢測(cè)，可提高肝癌患者與健康者間早期篩查診斷效能。在肝惡性和良性病變?cè)缙阼b別診斷中，miRNA7單獨(dú)檢測(cè)具有較好的臨床診斷價(jià)值，與AFP、CEA聯(lián)合檢測(cè)并不能有效提高早期篩查能力。

圖2 血清miRNA7、AFP、CEA單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的ROC曲線

表4 肝惡性組和對(duì)照組中血清miRNA7、AFP、CEA單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積（AUC）分析

表5 肝惡性組和良性組中血清miRNA7、AFP、CEA單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下 面積（AUC）分析

討 論

肝癌是世界上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，每年新增病例超過(guò)78.2萬(wàn)例，也是癌癥死亡的第二大原因，每年可導(dǎo)致74.6萬(wàn)例癌癥死亡，其中一半發(fā)生在中國(guó)，是種極其致命的疾病[16-17]。目前臨床診斷主要依靠影像學(xué)檢查、病理活檢和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)三種方式，相比于其他兩種，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)不僅能更好地對(duì)疾病進(jìn)展進(jìn)行診斷，而且不會(huì)對(duì)患者機(jī)體造成損傷、取材簡(jiǎn)便、診療費(fèi)用更低，更適用于肝癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療方針。

甲胎蛋白（AFP）主要由卵黃囊及肝細(xì)胞合成，在新生兒出生1歲后，其含量逐漸降低，正常成人AFP含量較低，若肝細(xì)胞發(fā)生癌變，機(jī)體血清AFP含量會(huì)顯著異常升高，但部分研究[18]表明，AFP診斷的假陽(yáng)性率較高，診斷效能并不理想。癌胚抗原（CEA）是一種腫瘤相關(guān)抗原，主要經(jīng)胃腸道代謝，故正常成人血清CEA含量較低，而肝癌患者可分泌大量CEA進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致血清CEA明顯升高。同時(shí)，大量研究表明，胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌以及心血管疾病等患者血清CEA含量均不同程度地升高[19-20]。因此，亟需新的血清腫瘤標(biāo)志物促進(jìn)肝癌的早期診斷和預(yù)后療效判斷。

臨床試驗(yàn)表明，血清miRNAs含量的變化與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[21]，高表達(dá)miR-21的肝癌患者血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）表達(dá)增加，而白蛋白（ALB）表達(dá)減低，上調(diào)miR-21可通過(guò)抑制SMAD7蛋白促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，且能提高肝癌患者的早期診斷和預(yù)后判斷能力。ZHU等[22]研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織（或細(xì)胞）中，miR-26a-5p表達(dá)異常降低，降低水平與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。MiR-26a-5p可直接靶向HMGA2抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-26a-5p的異常降低及其靶蛋白HMGA2的升高可能參與HCC發(fā)生發(fā)展的重要因素，miR-26a-5p可能是肝癌早期診斷和治療的潛在新靶點(diǎn)。循環(huán)miRNAs是穩(wěn)定、無(wú)創(chuàng)的腫瘤診斷生物標(biāo)志物，以外泌體等形式存在于血清中，在癌癥的大規(guī)模篩查或早期檢測(cè)中有很大的價(jià)值[23-24]。研究表明，血清miR-21、miR-122和miR-223在HCC或慢性肝炎患者中顯著升高，是區(qū)分HCC或慢性肝炎患者與健康對(duì)照組的有用標(biāo)志物[12]。然而，慢性肝炎患者血清miR-21和miR-122高于HCC，miR-223無(wú)顯著差異，僅僅這3種miRNAs可能對(duì)區(qū)分HCC和慢性肝炎患者無(wú)效。因此，需結(jié)合多種miRNAs，才能有效鑒別肝癌。本研究中，我們檢索了7種miRNAs（包括miR-21，miR-26a，miR-27a，miR-122，miR-192， miR-223，和miR-801）在數(shù)據(jù)庫(kù)ENCORI的生物信息發(fā)現(xiàn)，相比于肝正常組織，肝癌組織多種miRNAs的表達(dá)水平均發(fā)生顯著變化，提示miRNA7具有作為肝癌早期診斷血清標(biāo)志物的潛力。為此我們收集了75例肝惡性病變者、70例肝良性病變者以及32例健康體檢者，檢測(cè)受試者血清miRNA7、AFP和CEA含量。結(jié)果顯示相比于健康對(duì)照組及肝良性組，肝惡性組血清miRNA7、AFP和CEA的表達(dá)水平及陽(yáng)性率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)血清miRNA7腫瘤標(biāo)志物在肝癌患者的異常變化，對(duì)疾病的早期診斷具有重要價(jià)值。肝惡性組和對(duì)照組的ROC曲線顯示，血清miRNA7、AFP和CEA聯(lián)合檢測(cè)的AUC值明顯高于三者單獨(dú)檢測(cè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明三者聯(lián)合檢測(cè)可提高早期肝癌的診斷效能，為臨床肝癌早期診斷提供參考。另外，本研究在構(gòu)建肝惡性組和良性組間ROC曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)，血清miRNA7、AFP和CEA聯(lián)合檢測(cè)的AUC值也均高于單獨(dú)檢測(cè)，三者聯(lián)合檢測(cè)的AUC值與AFP、CEA間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與miRNA7間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由于本研究納入病例數(shù)有限，血清miRNA7與AFP、CEA在肝癌、肝良性病變以及健康者間早期診斷效能評(píng)估仍需更多研究驗(yàn)證。

綜上所述，血清標(biāo)志物miRNA7含量的檢測(cè)，有利于早期肝癌診斷的有效評(píng)估，且與AFP、CEA聯(lián)合檢測(cè)進(jìn)一步提高早期肝癌的診斷效能，降低高危人群惡性腫瘤致死率，為肝癌患者的預(yù)后療效判斷提供新的方向和手段。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突