張立群 肖堯 周曉陽 許曉東 蔡劍平

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是人類基因組中最為復(fù)雜的遺傳多態(tài)基因，它位于人類第6號染色體短臂21區(qū)（6p21.3）。HLA是免疫識別和免疫監(jiān)視的重要效應(yīng)分子，是器官移植成功率的關(guān)鍵影響因素之一[1]，HLA-A、B和DRB1三位點基因配型是器官移植中供者篩選的主要依據(jù)[1-2]。為給臨床移植提供可靠的配型數(shù)據(jù)，HLA基因分型質(zhì)量受到了國內(nèi)外專家的高度重視，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心組織的能力驗證活動是提高實驗室HLA基因分型質(zhì)量的重要措施[3]。國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心已開展了十幾年的HLA基因分型的能力驗證工作[4]，隨著HLA分型技術(shù)的不斷發(fā)展，本文對2017～2020年HLA基因分型PT項目的回報結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)，對產(chǎn)生的錯誤以及導(dǎo)致錯誤的原因進(jìn)行了分析，為HLA基因分型實驗室的質(zhì)量提升提供數(shù)據(jù)支持。

材料與方法

1 材料

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及DNA質(zhì)控品的制備：培養(yǎng)人永生化HLA標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株，長到合適密度后提取基因組DNA，測濃度并將最終濃度調(diào)整為80～120 ng/μL，純度（A260/A280）控制在1.80～1.95之間。按中國合格評定國家認(rèn)可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment， 簡稱CNAS）文件CNAS-GL03《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》的要求[5]，每個樣品編號隨機(jī)抽取10個樣品，每個樣品重復(fù)測試濃度2次，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計，F(xiàn)α＜0.05確認(rèn)質(zhì)控品均勻性符合要求；完成制備的樣本分別在室溫和4℃下進(jìn)行6個月的穩(wěn)定性檢驗，電泳法確認(rèn)其完整性，HLA分型檢測確認(rèn)基因型無改變以滿足穩(wěn)定性要求。

1.2 質(zhì)控品HLA型別的設(shè)計及確認(rèn)原則：以中國人群常見及確認(rèn)等位基因頻率為依據(jù)，根據(jù)中國版CWD表確定需要開發(fā)的HLA基因型別。每個樣本的靶值采用2家以上廠商試劑3種以上檢測方法進(jìn)行確認(rèn)，必要時在PT活動中根據(jù)各實驗室回報結(jié)果進(jìn)行修正。臨床樣本一般為抗凝全血，本質(zhì)控品為提取好的基因組DNA，基質(zhì)為TE緩沖液，參與實驗室將質(zhì)控品視作提取好的DNA樣品直接使用。

2 方法

2.1 分發(fā)質(zhì)控品：HLA質(zhì)控品發(fā)放頻率為1次/年，發(fā)放數(shù)量為6支/次。

2.2 檢測位點和檢測時限要求：本PT項目的檢測位點為HLA-A、B、DRB1位點（均為低分辨基因分型），要求實驗室在收到質(zhì)控品后1周內(nèi)回報分型檢測數(shù)據(jù)（每個位點含兩個等位基因）。

2.3 對HLA基因分型結(jié)果的評價：每個分型實驗室需要返回18個基因分型數(shù)據(jù)（6支質(zhì)控品，每個質(zhì)控品3個位點）。將所有實驗室的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析比對并與靶值數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，計算各實驗室對HLA-A、B、DRB1位點基因分型檢測的總正確率和各位點的正確率，對錯誤數(shù)據(jù)的產(chǎn)生原因進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對等位基因錯誤數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。年度間數(shù)據(jù)錯誤率采用Fisher精確檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 參與PT活動實驗室數(shù)量的變化 2017年參與本PT項目的實驗室為78家，2018年為82家，2019年為80家，2020年增加至96家，提示我國開展HLA低分辨基因分型檢測的臨床實驗室呈逐步增加的趨勢。

2 分型技術(shù)類別匯總 實驗室采用的分型技術(shù)主要包括序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分型技術(shù)（polymerase chain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP）、序列特異性寡核苷酸探針雜交-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分型技術(shù)（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probe，PCR-SSO）和基于DNA序列的分型技術(shù)（sequencing-based typing，SBT）。2017～2020年采用的分型技術(shù)類別詳見表1。從表中可以看出，PCRSSP仍然是我國大多數(shù)HLA低分辨實驗室采用的分型技術(shù)，但PCR-SSO分型技術(shù)顯著增加，DNA測序技術(shù)占比較小增長率也不明顯。

表1 2017～2020年HLA基因低分辨分型PT活動中實驗室采用的技術(shù)類型

3 等位基因的錯誤率分析 2017～2020年共收到回報等位基因數(shù)據(jù)12 096例，各年度的錯誤數(shù)量詳見表2。分析發(fā)現(xiàn)，2017～2020年各年度之間的數(shù)據(jù)總體錯誤率有顯著性差異（Z=113.4，P＜0.05）。2019年度錯誤率顯著高于2018年，2018年度錯誤率顯著高于2017年和2020年，2017年與2020年的錯誤率沒有顯著差異。

表2 2017～2020年HLA基因低分辨分型回報錯誤等位基因的統(tǒng)計［錯誤數(shù)據(jù)例數(shù)/數(shù)據(jù)總例數(shù)（%）］

4 HLA低分辨基因分型錯誤數(shù)據(jù)分析

4.1 總體情況：在2017年、2018年、2019年和2020年P(guān)T活動中，分別有2家、4家、7家和3家實驗室出現(xiàn)HLA分型錯誤，占比分別為2.56%（2/78）、4.88%（4/82）、8.75%（7/80）、3.13%（3/96），其中2018年3號實驗室（來自遼寧）的3個位點全部錯誤（包括錄入錯誤與選錯位點的錯誤），2019年6號和8號實驗室（來自遼寧和四川）3個位點全部錯誤且錯誤相同（包括錄入錯誤與選錯位點的錯誤），2019年9號和10號實驗室（來自北京和江蘇）的DRB1位點全部上報為C位點且錯誤相同，2020年13號實驗室（來自廣東）的B位點全部錯誤（表3）。

表3 2017年～2020年HLA基因分型檢測PT活動中錯誤結(jié)果明細(xì)

4.2 HLA-A、B、DRB1位點分型錯誤類別及來源分析：實驗室分型錯誤的類型主要包括技術(shù)錯誤和人為錯誤，技術(shù)錯誤又分為雜合子的判別錯誤和純合子的判別錯誤，主要來源于對DNA序列識別的錯誤或擴(kuò)增偏倚；人為錯誤主要來源于填報位點錯誤（如把A位點的數(shù)據(jù)填到了B位點等）和輸入錯誤（如把結(jié)果編碼和分型結(jié)果進(jìn)行了混淆），詳見表4。實驗室的分型錯誤主要為人為錯誤，連續(xù)4年來人為輸入錯誤共計28份，填報位點錯誤共計76份。

表4 2017～2020年HLA基因分型檢測HLA-A、-B、-DRB1各位點的錯誤類型

4.3 檢測方法的錯誤率比較：扣除錄入錯誤及位點填報錯誤等人為錯誤類型后，將2017～2020年所有分析位點按SSP、SSO、SBT三種檢測方法的錯誤率進(jìn)行比較，分析發(fā)現(xiàn)，SSP分型方法的錯誤率顯著高于SSO和SBT法（Z=6.22，P=0.045＜0.05），詳細(xì)數(shù)據(jù)見表5。

表5 2017～2020年所有位點的分型方法錯誤率統(tǒng)計［錯誤例數(shù)/總例數(shù)（錯誤率，%）］

討 論

能力驗證是評估臨床實驗室檢測能力的有效工具，早在20世紀(jì)末國際上就已經(jīng)開展了HLA基因分型的PT活動[6-10]，2003年我國HLA低分辨分型的PT活動開始啟動，由國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心（原衛(wèi)生部臨床檢驗中心）和中國造血干細(xì)胞資料庫管理中心質(zhì)控實驗室負(fù)責(zé)。本項PT活動已在醫(yī)療機(jī)構(gòu)及第三方檢測機(jī)構(gòu)連續(xù)開展了17年，近4年的PT項目整體錯誤率為1.05%，稍高于其他國家或地區(qū)[6-10]。近4年出現(xiàn)錄入錯誤和填報位點錯誤較多，說明還需要加強(qiáng)對實驗人員及結(jié)果上報人員的監(jiān)督和管理工作，以降低類似錯誤的發(fā)生。

從近4年的統(tǒng)計分析中可以看出，約70%的實驗室仍采用PCR-SSP法，23例等位基因錯誤中有21例是由PCR-SSP法產(chǎn)生，2例由PCR-SSO法產(chǎn)生。下面對錯誤產(chǎn)生的可能原因進(jìn)行分析：

（1）方法學(xué)：23例技術(shù)錯誤中，共有5例（21.7%）屬于純合子基因分型錯誤，其中A位點2例、B位點2例、DRB1位點1例；共有18例（78.3%）屬于雜合子基因分型錯誤，其中A位點3例、B位點12例、DRB1位點3例。23例錯誤中21例均由PCRSSP技術(shù)產(chǎn)生，SSP方法的錯誤率（0.26%）顯著高于SSO法（0.05%）和SBT法（0.00%），這主要是因為SSP方法操作繁瑣、擴(kuò)增引物數(shù)量有限所致。下邊主要對PCR-SSP技術(shù)分型錯誤進(jìn)行分析：

①DNA聚合酶：Taq酶加入量不足或質(zhì)量不過關(guān)，將導(dǎo)致DNA擴(kuò)增效率下降，出現(xiàn)檢測偏倚；Taq酶加入量過多，假陽性擴(kuò)增條帶可能出現(xiàn)，導(dǎo)致分型錯誤[11]。

②電泳時加樣錯誤：上樣孔數(shù)量太多，若加孔錯誤將會導(dǎo)致假陽性或假陰性條帶的出現(xiàn)從而導(dǎo)致分型錯誤。

③標(biāo)識錯誤：陽性孔的位置標(biāo)識錯誤，在判讀過程產(chǎn)生混淆。

④引物設(shè)計缺陷：引物擴(kuò)增位置設(shè)計不合理，導(dǎo)致擴(kuò)增偏倚。

⑤未及時更新新基因：如果新等位基因的頻率較高但試劑廠商未定期更新產(chǎn)品設(shè)計，將會導(dǎo)致漏檢。

（2）試劑原因：近4年的能力驗證參與實驗室共采用了10余種不同廠商的PCR-SSP分型試劑，尚未發(fā)現(xiàn)HLA分型錯誤結(jié)果與分型試劑間具有明顯的相關(guān)性。

（3）人為錯誤：主要是填報位點錯誤和人為錄入錯誤。近4年P(guān)T出現(xiàn)的127例錯誤數(shù)據(jù)中有104例（81.9%）屬于該類錯誤。其中28例為錄入錯誤，主要是將結(jié)果編碼和分型數(shù)據(jù)混淆所致；有76例為填報位點錯誤，如A位點填入了B位點基因型，這種低級錯誤應(yīng)杜絕發(fā)生，反映出某些實驗室人員在檢測或上報結(jié)果時存在麻痹大意的情形。

綜上，2017～2020年度HLA分型錯誤以HLA填報位點錯誤發(fā)生率最高，錄入錯誤次之，分型技術(shù)錯誤占比最小。分型技術(shù)錯誤中以PCR-SSP方法為主，這與以往的報道相一致[12]。需要特別注意的是，在該4年度PT活動中，6/8號實驗室出現(xiàn)了A、B和DRB1三個位點全部相同的錯誤， 9/10號實驗室出現(xiàn)了DRB1位點完全相同的錯誤，這在常規(guī)檢測過程中幾乎是不可能出現(xiàn)的，需要引起相關(guān)實驗室的高度警惕。

PT作為質(zhì)量管理的一部分，可輔助HLA分型實驗室鑒別實驗過程及檢測報告出具過程中存在的問題和偏差，以便及時采取糾正措施。能力驗證報告發(fā)布后，各參與實驗室結(jié)合能力驗證報告對錯誤結(jié)果進(jìn)行剖析并對相關(guān)人員進(jìn)行培訓(xùn)教育，實驗室的HLA分型檢測水平可獲得顯著提升[13]。由于本項目質(zhì)控品為提取好的人類基因組DNA，無法對參評實驗室的DNA提取過程進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，這也是本質(zhì)控品的不足之處。作為能力驗證項目的提供者，我們將竭盡所能提供高質(zhì)量的人類基因組質(zhì)控品，按時發(fā)布每年的能力驗證報告，及時進(jìn)行學(xué)術(shù)交流和溝通，與各實驗室一道為我國HLA基因分型檢測水平的提升作出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突