黃孝權(quán)，何人大，魏譚軍，周殿儒，肖成，陳飛，周曉維*，陳勇

1.達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 達(dá)州 635000；2.成都地奧集團(tuán)天府藥業(yè)有限公司，四川 達(dá)州 635027

屏風(fēng)生脈膠囊由黃芪、防風(fēng)、麥冬、人參、白術(shù)、五味子和附子組成，主要用于心悸氣短、表虛自汗、乏力眩暈、易感風(fēng)邪。現(xiàn)代研究表明，屏風(fēng)生脈膠囊對慢性蕁麻疹[1-2]、支氣管哮喘[3-4]、室性早搏[5]、病毒性心肌炎[6]及老年冠心病心絞痛[7]治療效果顯著，易被廣大患者接受。屏風(fēng)生脈膠囊中黃芪補(bǔ)氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血、行滯通痹；防風(fēng)祛風(fēng)解表、止痛止痙；麥冬養(yǎng)陰生津、潤肺清心；人參大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智；白術(shù)健脾益氣、燥濕利水；五味子收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心；附子回陽救逆、散寒止痛。諸藥合用，共奏固衛(wèi)御風(fēng)、益氣養(yǎng)陰之功效。目前，屏風(fēng)生脈膠囊國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[8]及文獻(xiàn)[9-13]中僅以1或2個成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，均難以客觀評價其整體質(zhì)量，也難以確保臨床療效的一致性，多指標(biāo)控制模式已逐步應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量評價中。傳統(tǒng)的多指標(biāo)控制模式因某些對照品不易得到或部分對照品價格昂貴、穩(wěn)定性差，推廣應(yīng)用具有一定的局限性，而一測多評法（QAMS）以制劑中某一質(zhì)量穩(wěn)定、價格低廉、易得的指標(biāo)成分作為內(nèi)參物，通過相對校正因子（RCF）計算其他成分的含量，最終達(dá)到多個組分的同時測定，有效地解決了部分對照品不穩(wěn)定、價格昂貴、不易獲得、檢驗成本過高等傳統(tǒng)多成分質(zhì)量控制模式的不足。本研究以屏風(fēng)生脈膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 為質(zhì)量控制指標(biāo)，采用高效液相色譜一測多評法（HPLC-QAMS）對上述9 個成分含量進(jìn)行同步測定，建立屏風(fēng)生脈膠囊多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，以期為屏風(fēng)生脈膠囊質(zhì)量控制新體系提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（安捷倫公司）、LC-2030 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB265-S型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BRANSON 5510 型超聲提取器（上海滬沁儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素苷（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111920-201907、111522-201913，純度分別為96.8%、94.6%）；芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素、亥茅酚苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號分別為PRF9060501、PRF8101143、PRF8091225、PRF9122902、PRF9121702、PRF8041122、PRF7102423，純度分別為99.6%、99.1%、99.9%、99.5%、99.1%、99.9%、98.3%）；屏風(fēng)生脈膠囊（每粒裝0.33 g）分別購于綿陽一康制藥有限公司（批號分別為191001、200501、201101、210201，編號為S1～S4）、廣州諾金制藥有限公司（批號分別為8421101、8421302、8421501、8421503，編號為S5～S8）和山西康威制藥有限責(zé)任公司（批號分別為1130109、1130111、1130118、1130311，編號為S9～S12）；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

陰性對照試驗所用藥材黃芪（批號：210103-1）、防風(fēng)（批號：210215-2）、麥冬（批號：210116-1）、人參（批號：210302-2）、白術(shù)（批號：210107-1）、五味子（批號：201201-1）和附子（批號：210211-2）均來源于四川仁禾中藥飲片有限公司，經(jīng)達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院周曉維主管藥師鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取9 個對照品各適量，精密稱定，用甲醇制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 質(zhì)量濃度分別為0.536、0.352、0.430、0.874、1.316、0.498、0.376、0.272、0.218 mg·mL–1的混合對照品儲備液。將混合對照品儲備液稀釋20 倍得對照品溶液（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 質(zhì)量濃度分別為26.8、17.6、21.5、43.7、65.8、24.9、18.8、13.6、10.9 μg·mL–1）。

2.2 供試品溶液的制備

取屏風(fēng)生脈膠囊內(nèi)容物2 g，精密稱定，加甲醇20 mL，對供試品超聲處理45 min，放冷，甲醇稀釋至25 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為屏風(fēng)生脈膠囊供試品溶液。取按屏風(fēng)生脈膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下處方和制法制備的缺黃芪、缺防風(fēng)、缺麥冬的陰性供試品各適量，按上述方法依次制得陰性供試品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱Agilent ZORAX StableBond C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為30 ℃；檢測波長分別為254 nm（0～36 min，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷）[14-20]和296 nm（36～60 min，麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B）[21-23]；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～9 min，13%A；9～24 min，13%～33%A；24～36 min，33%～45%A；36～52 min，45%～68%A；52～60 min，68%～13%A）；流速為1.0 mL·min–1；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按9個指標(biāo)成分計均應(yīng)≥5500。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 精密吸取2.1、2.2項下溶液各10μL，按2.3項下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果屏風(fēng)生脈膠囊供試品溶液中9 個指標(biāo)成分與相鄰色譜峰分離良好，分離度均大于1.5；所檢測指標(biāo)成分色譜峰峰形對稱，拖尾因子符合《中華人民共和國藥典》2020 年版（四部）規(guī)定；陰性供試品對9個指標(biāo)成分的測定無干擾。

圖1 混合對照品、屏風(fēng)生脈膠囊供試品及陰性供試品HPLC圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.1 項下混合對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，置不同的20 mL 量瓶中，用甲醇定容制成6 個混合對照品溶液，按2.3項下色譜條件進(jìn)樣10μL，以9 個指標(biāo)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸（表1）。

表1 屏風(fēng)生脈膠囊中9個指標(biāo)成分的線性關(guān)系

2.4.3 精密度試驗 按2.3項下色譜條件進(jìn)樣屏風(fēng)生脈膠囊（編號：S1）同一份供試品溶液10μL，重復(fù)操作6 次，測得指標(biāo)成分峰面積的RSD 分別為1.26%、1.33%、1.20%、0.87%、0.61%、1.19%、1.35%、1.29%、1.45%。

2.4.4 重復(fù)性試驗 按2.2 項下方法制備6 份屏風(fēng)生脈膠囊（編號：S1）供試品溶液，依次進(jìn)樣10μL分析，得指標(biāo)成分含量的RSD 分別為1.57%、1.77%、1.69%、1.45%、1.09%、1.86%、1.74%、1.83%、1.91%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 分別于0、2、4、8、16、24 h按2.3項下色譜條件進(jìn)樣屏風(fēng)生脈膠囊（編號：S1）同一份供試品溶液10 μL，得指標(biāo)成分峰面積的RSD分別為1.38%、1.41%、1.26%、0.95%、0.58%、1.12%、1.29%、1.31%、1.40%。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知9 個指標(biāo)成分含量的屏風(fēng)生脈膠囊內(nèi)容物9 份，每份1 g，精密稱定，均分成3組，精密加入混合對照品溶液（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B的質(zhì)量濃度分別為0.309、0.195、0.246、0.583、0.934、0.261、0.225、0.149、0.108 mg·mL–1）0.8、1.0、1.2 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，各精密吸取10 μL，按2.3項下方法進(jìn)樣檢測，見表2。

表2 屏風(fēng)生脈膠囊中9個指標(biāo)成分的加樣回收率試驗結(jié)果

2.5 QAMS評價模式的建立

2.5.1 RCF 的建立 按2.3項下色譜條件進(jìn)樣2.4.2項下6 個混合對照品溶液各10 μL，按公式（1）計算各成分RCF。

式中?為校正因子，W為質(zhì)量濃度，A為峰面積，k為其他待測成分，s為內(nèi)參物。

以升麻素為內(nèi)參物，分別計算其他8 個指標(biāo)成分的RCF（表3）。

表3 屏風(fēng)生脈膠囊中其他8個指標(biāo)成分的RCF

2.5.2 不同儀器及色譜柱對RCF的影響 分別選用安捷倫1260 型、島津LC-2030 型高效液相色譜儀和色譜柱（Agilent ZORAX StableBond C18、Waters Nova-Pak C18、迪馬Spursil C18），進(jìn)樣2.1 項下對照品溶液10 μL，得升麻素對其他8 個指標(biāo)成分的RCF（表4）。

表4 儀器及色譜柱對屏風(fēng)生脈膠囊中其他8個指標(biāo)成分的RCF的影響

2.5.3 不同流速對RCF的影響 在不同流速（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min–1）條件下，按2.3項下色譜條件進(jìn)樣2.1 項下對照品溶液10 μL，得升麻素對其他8個指標(biāo)成分的RCF（表5）。

表5 流速對屏風(fēng)生脈膠囊中其他8個指標(biāo)成分的RCF的影響

2.5.4 不同柱溫對RCF 的影響 在不同柱溫（25、28、30、32、35 ℃）條件下，按2.3項下色譜條件進(jìn)樣2.1 項下對照品溶液10μL，得升麻素對其他8 個指標(biāo)成分的RCF（表6）。

表6 柱溫對屏風(fēng)生脈膠囊中其他8個指標(biāo)成分的RCF的影響

2.5.5 色譜峰定位 按2.3項下色譜條件進(jìn)樣2.1 項下對照品溶液10μL，采用相對保留時間值法對待測成分色譜峰進(jìn)行定位，考察儀器（安捷倫1260 型、島津LC-2030 型高效液相色譜儀）和色譜柱（Agilent ZORAX StableBond C18、Waters Nova-Pak C18、迪馬Spursil C18）對相對保留時間的影響（表7）。

表7 不同儀器及色譜柱對屏風(fēng)生脈膠囊中其他8個指標(biāo)成分的相對保留時間的影響

2.6 QAMS與外標(biāo)法（ESM）測定結(jié)果比較

為驗證所建立的QAMS 的準(zhǔn)確性和可行性，取3 個廠家12 批屏風(fēng)生脈膠囊，按2.2 項下方法制備屏風(fēng)生脈膠囊供試品溶液，按2.3項下色譜條件進(jìn)樣分析，分別運(yùn)用ESM 和QAMS計算屏風(fēng)生脈膠囊中9 個指標(biāo)成分的含量，比較2 種方法檢測結(jié)果的差異（表8）。

表8 屏風(fēng)生脈膠囊中9個指標(biāo)成分含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

屏風(fēng)生脈膠囊由黃芪、防風(fēng)、麥冬、人參、白術(shù)、五味子、附子組成組方，方中黃芪和人參補(bǔ)益元?dú)狻⒐瘫碇购篂榫?；白術(shù)和防風(fēng)健脾益氣為臣藥；五味子和麥冬斂陰止汗為佐藥；附子溫腎壯陽為使藥。本研究以君藥所含成分為主，兼顧臣佐藥所含成分，選取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B共9個指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。

3.2 流動相的確定

首先取甲醇-水[18-20]和乙腈-水[21]為流動相，以屏風(fēng)生脈膠囊中9 個指標(biāo)成分的色譜峰峰形、分離效果、響應(yīng)值為主要指標(biāo)，兼顧檢驗用時、基線情況等，結(jié)果乙腈-水優(yōu)于甲醇-水，但升麻素苷與升麻素不能有效分離。遂以乙腈為有機(jī)相，參考相關(guān)文獻(xiàn)對乙腈-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.1% 甲酸溶液[14-16,22-23]進(jìn)行對比考察，最終乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相梯度洗脫，對屏風(fēng)生脈膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B含量進(jìn)行同時檢測。

3.3 供試品制備方法的確定

本研究在制備屏風(fēng)生脈膠囊供試品溶液時，逐個考察了甲醇[14-15,17-21]、水[16]、80%甲醇[22]、70%甲醇[23]4 種提取溶劑及加熱回流[14,20]、超聲[15,17-19,21-23]2 種提取方式，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B 綜合提取率為首要指標(biāo)，最終確定采用甲醇超聲處理45 min 為屏風(fēng)生脈膠囊供試品制備方法[21]。

本研究所建立的HPLC-QAMS 結(jié)果準(zhǔn)確，可用于對屏風(fēng)生脈膠囊中9 個指標(biāo)成分的同步定量分析，能夠作為屏風(fēng)生脈膠囊多指標(biāo)成分質(zhì)量控制方法；同時也反映出9 個指標(biāo)成分存在一定的批間差異，表明多指標(biāo)成分質(zhì)量控制對穩(wěn)定屏風(fēng)生脈膠囊產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床用藥療效的一致性具有重要意義。