秦 璐，宋秀凱，劉麗娟，馬元慶，姜向陽，王 寧，汝少國，王 軍*

1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003

2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺 264006

高效氟吡甲禾靈(haloxyfop-P-methyl, HPME)是一種芳氧苯氧丙酸酯類除草劑，能夠很好地防除大多數(shù)一年生和多年生的禾本科雜草，在我國每年使用作物面積近7 萬畝次，合計(jì)3×104t 以上[1]. 近年來，隨著此類除草劑長期單一的不合理使用，致使其在環(huán)境中被廣泛檢出[2-3]. 如我國湖南某煙草基地附近水體中芳氧苯氧丙酸酯類除草劑精喹禾靈的濃度約為16 μg/L[4]，松花江水體中HPME 的濃度為3.7～9.8 μg/L[5].據(jù)報(bào)道顯示，當(dāng)土壤中HPME 的施用量為360～540 g/hm2時(shí)，其殘留量約為0.02～0.159 mg/kg[6]；Oliveira等[7]推算出施用濃度為122.35 g/L 的HPME 會導(dǎo)致地表徑流中HPME 濃度高達(dá)183 mg/L. 除了用于防治農(nóng)田雜草外，HPME 還能夠有效殺死我國近海入侵植物互花米草，抑制其有性繁殖和無性繁殖，被認(rèn)為是防控互花米草的有效化學(xué)方法[8]. 互花米草在我國沿海灘涂的快速擴(kuò)散破壞了鳥類覓食與棲息環(huán)境、改變了底棲動物群落組成，已成為濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)健康的重大威脅[9]. 目前，多個(gè)沿海地區(qū)已經(jīng)啟動了互花米草的防治工作，這對恢復(fù)生態(tài)環(huán)境與生物多樣性具有重大意義[10]. 化學(xué)方法是防治互花米草的經(jīng)濟(jì)、有效方法，但是施藥過程會導(dǎo)致未被互花米草吸收的除草劑進(jìn)入海洋環(huán)境，可能會對生態(tài)系統(tǒng)健康造成潛在危害.

目前，關(guān)于HPME 對淡水生物的毒性數(shù)據(jù)很少，對海洋生物的毒性效應(yīng)研究鮮見報(bào)道. HPME 對四尾柵藻(Scenedesmus quadricauda)的96 h 半數(shù)效應(yīng)濃度(median effect concentration, EC50)為62.8 mg/L[11]，對藍(lán)鰓太陽魚(Lepomis macrochirus)的96 h-LC50為0.3 mg/L[12]. HPME 還會對水生生物的生長發(fā)育產(chǎn)生毒性效應(yīng). 例如，0.723 mg/L HPME 暴露會導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育不良，并且3.617 mg/L HPME 暴露24 h會造成斑馬魚胚胎死亡[13]. 此外，1 mg/L HPME 暴露斑馬魚仔魚72 h 會引發(fā)脊柱變形、運(yùn)動減慢、心率和存活率明顯下降等現(xiàn)象[14-15]. 可見，在互花米草治理過程中盲目地使用HPME 很可能造成較大的生態(tài)危害. 因此，亟需確定HPME 的生態(tài)安全閾值，并制訂其水質(zhì)基準(zhǔn).

水質(zhì)基準(zhǔn)是指污染物對人或其他生物不產(chǎn)生有害影響的最大可接受劑量[16-18]. 國際上水質(zhì)基準(zhǔn)的推導(dǎo)多采用物種敏感性分布(species sensitivity distribution, SSD)和物種敏感性排序法(species sensitivity rank, SSR). 水質(zhì)基準(zhǔn)的推導(dǎo)依賴于化合物的毒性數(shù)據(jù)庫[19]. 例如，US EPA 制定的“推導(dǎo)保護(hù)水生生物及其用途的水質(zhì)基準(zhǔn)的技術(shù)指南”中指出，至少需要3 門8 科毒性數(shù)據(jù)要求[16]. 鑒于目前缺乏HPME 對海洋生物的毒性數(shù)據(jù)，該研究首先選取了8門13 科本地海洋生物開展HPME 急性毒性試驗(yàn). 同時(shí)，通過搜集現(xiàn)有毒性數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)，構(gòu)建了HPME 對水生生物的毒性數(shù)據(jù)庫. 隨后，利用SSD 法和SSR 法分別推導(dǎo)HPME 的水質(zhì)基準(zhǔn)，以期為HPME在互花米草治理中的安全施用與風(fēng)險(xiǎn)評估提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 毒性數(shù)據(jù)的搜集與篩選

該文所采用的HPME 毒性數(shù)據(jù)來自于國內(nèi)外已有的毒性數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)資料，主要來源包括US EPA的ECOTOX 毒性數(shù)據(jù)庫(https://cfpub.epa.gov/ecotox)、NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、中國知網(wǎng)(http://www.cnki.net). 急性毒性數(shù)據(jù)主要選取24～96 h 的LC50和EC50[20]，在篩選數(shù)據(jù)過程中，如果一個(gè)物種有多個(gè)符合要求的數(shù)據(jù)，取其幾何均值來代表該物種的生物毒性數(shù)據(jù)[21].

1.2 急性毒性試驗(yàn)

該文使用的HPME (CAS 號95977-29-0)乳油，購自江蘇中旗科技股份有限公司，有效成分含量為108 g/L. 用滅菌海水配置有效濃度為4.5 mg/L 的母液，避光保存于4 °C，每天配置新的母液.

該文選取8 門13 科13 種具有代表性的本地海洋生物進(jìn)行研究，涵蓋初級生產(chǎn)者、初級消費(fèi)者、次級消費(fèi)者3 個(gè)營養(yǎng)級. 急性毒性試驗(yàn)方法參照我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 27861—2011《化學(xué)品 魚類急性毒性試驗(yàn)》、GB/T 21805—2008《化學(xué)品 藻類生長抑制試驗(yàn)》、GB/T 13266—1991《水質(zhì)物質(zhì)對蚤類(大型蚤)急性毒性測定方法》)等標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法進(jìn)行. 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定暴露濃度梯度范圍，每種生物設(shè)置不同HPME 濃度梯度暴露組(見表1)和滅菌海水空白對照組. 所有試驗(yàn)動物試驗(yàn)期間均不喂食，采用半靜態(tài)暴露，每隔24 h 更換一次暴露液，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行組包含至少10 個(gè)生物體. 試驗(yàn)期間每天測定溫度、鹽度和pH 等，以保證試驗(yàn)環(huán)境穩(wěn)定.藻類急性毒性試驗(yàn)以藻細(xì)胞數(shù)量為終點(diǎn)指標(biāo)，動物急性毒性試驗(yàn)以個(gè)體存活數(shù)為終點(diǎn)指標(biāo). 每24 h 進(jìn)行1～3 次觀察記錄，及時(shí)撈出死亡個(gè)體，以防污染水質(zhì).所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8 繪制藻類生長抑制率曲線以及劑量效應(yīng)曲線，采用SPSS 16 和Probit 方法計(jì)算LC50、EC50及相應(yīng)的95%置信區(qū)間.

表 1 高效氟吡甲禾靈對13 種本地海洋生物的急性毒性試驗(yàn)Table 1 The exposure concentration gradients of haloxyfop-P-methyl to 13 native marine organisms

1.3 水質(zhì)基準(zhǔn)推導(dǎo)

1.3.1 SSD 法

將毒性數(shù)據(jù)分為兩組：該研究開展的13 種海水生物毒性數(shù)據(jù)與7 種淡水+13 種海水生物毒性數(shù)據(jù).采用Log-logistic、Gamma、Log-normal、Log-gumbel、Weibull 等5 種模型分別對兩組毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，構(gòu)建HPME 的SSD 曲線，并采用赤池信息量準(zhǔn)則(Akaike′s information criterion, AIC 準(zhǔn)則)、樣本修正的赤池信息準(zhǔn)則(Akaike′s information criterion corrected for sample size, AICC)、貝葉斯信息準(zhǔn)則(Bayesian information criterion, BIC)、 Kolmogorov Smirnov 檢 驗(yàn)(KS 檢 驗(yàn))和Anderson-Darling 檢 驗(yàn)(AD 檢驗(yàn))方法評估吻合度擬合效果[22-23]. SSD 模型構(gòu)建及吻合度檢驗(yàn)使用統(tǒng)計(jì)軟件R 3.5.2 中的ssdtools 包完成. 最優(yōu)SSD 曲線使用Matlab (2012 b)進(jìn)行擬合.

1.3.2 SSR 法

將兩組數(shù)據(jù)根據(jù)物種屬名分類，分別有13 屬和19 屬，計(jì)算同一屬內(nèi)所有物種急性毒性數(shù)據(jù)的平均值，即屬平均急性值(genus mean acute value, GMAV)，將GMAV 從小到大進(jìn)行排序并分配等級n，兩組數(shù)據(jù)GMAV 最小的4 個(gè)屬及等級均為偽鏢水蚤屬(安氏偽鏢水蚤)，1 等級；猛水蚤屬(日本虎斑猛水蚤)，2等級；臂尾輪蟲屬(褶皺臂尾輪蟲)，3 等級；等鞭金藻屬(球等鞭金藻)，4 等級. 按P=n/(N+1)(N為屬的個(gè)數(shù))計(jì)算累積概率；按式(1)～(4)[16]計(jì)算最終急性值(final acute value, FAV)，其中FAV 對應(yīng)SSD 法的HC5[24].

式中：S、L、A均為FAV 計(jì)算的過程量；P為選擇4個(gè)屬毒性數(shù)據(jù)的排序百分?jǐn)?shù)(也稱累積概率). 數(shù)據(jù)的分類匯總及SSR 法計(jì)算在Excel 軟件中完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 毒性數(shù)據(jù)收集和篩選

該文共收集到HPME 對7 種淡水生物的急性毒性數(shù)據(jù)，所涉及生物分屬于3 門5 科，包括2 種魚類、4 種藻類和1 種甲殼動物(見表2). HPME 的急性毒性數(shù)據(jù)范圍為0.3 mg/L (藍(lán)鰓太陽魚，96 h-LC50)到62.8 mg/L(四尾柵藻，96 h-EC50)，二者相差約210 倍.有研究表明，與HPME 同為芳氧苯氧丙酸酯類除草劑的惡唑酰草胺(10%乳液)對斜生柵藻的72 h-EC50為1.698 mg/L，對斑馬魚的96 h-LC50為0.432 mg/L，對藻類的毒性低于對魚類的毒性[28]，這與該文搜集數(shù)據(jù)的結(jié)果相一致. 因此，芳氧苯氧丙酸酯類除草劑對魚類的急性毒性要明顯高于藻類，提示這類除草劑會對高等水生動物產(chǎn)生更大的毒性效應(yīng).

表 2 高效氟吡甲禾靈對7 種淡水生物的急性毒性數(shù)據(jù)Table 2 Acute toxicity data of haloxyfop-P-methyl to 7 freshwater organisms

2.2 急性毒性試驗(yàn)

以暴露濃度為橫坐標(biāo)，以基于生長量的生長抑制率或存活率為縱坐標(biāo)繪制劑量-效應(yīng)折線圖(見圖1).HPME 的急性毒性數(shù)據(jù)范圍為0.107～47.111 mg/L(見表3)，并且藻類的生長抑制率和其他生物的死亡率均與HPME 的濃度呈正相關(guān). 不同生物對HPME 的敏感性表現(xiàn)為安氏偽鏢水蚤＞虎斑猛水蚤＞褶皺臂尾輪蟲＞球等鞭金藻＞許氏平鲉＞中肋骨條藻＞黑褐新糠蝦＞四角蛤蜊＞刺參＞紫貽貝＞蛋白核小球藻＞琵琶擬沼螺＞牡蠣. 對HPME 最敏感的物種安氏偽鏢水蚤的96 h-LC50值(0.107 mg/L)與最不敏感物種牡蠣的96 h-LC50值(47.111 mg/L)在數(shù)值上相差400 多倍，這與該研究數(shù)據(jù)庫搜集的結(jié)果相一致. 有研究[28]顯示，惡唑酰草胺乳油對大型溞和斑馬魚的48 h-LC50和96 h-LC50分別為0.112 和0.432 mg/L，屬高毒；對斜生柵藻的72 h-EC50為1.698 mg/L，屬中毒. 氰氟草酯對斑馬魚成魚和胚胎的96 h-LC50分別為4.05 和0.57 mg/L，精喹禾靈對斑馬魚胚胎的96 h-LC50為0.23 mg/L，為高毒[29]. 此外，氰氟草酯對隆線溞的毒性也高于蛋白核小球藻，對隆線溞的48 h-LC50為51.91 mg/L，而200 mg/L 氰氟草酯僅抑制58%蛋白核小球藻生長[30-31]. 在該研究中，HPME 對中肋骨條藻和球等鞭金藻的96 h-LC50在0.233～0.604 mg/L 之間，而對蛋白核小球藻的96 h-LC50則高達(dá)2.396 mg/L，與紫貽貝的數(shù)值相近. 可見，不同生物對芳氧苯氧丙酸酯類除草劑的敏感性存在較大差異. 為準(zhǔn)確評估這類污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，非常有必要補(bǔ)充更多物種的毒性數(shù)據(jù).

表 3 高效氟吡甲禾靈對13 種本地海洋生物的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Acute toxicity results of haloxyfop-P-methyl to 13 native marine organisms

2.3 水質(zhì)基準(zhǔn)推導(dǎo)結(jié)果

2.3.1 SSD 法

SSD 法是一種基于統(tǒng)計(jì)的方法，將不同生物對污染物的敏感性分布通過一定的函數(shù)進(jìn)行擬合，構(gòu)建物種的敏感性分布曲線，求得能保護(hù)一定百分比生物的環(huán)境濃度值，通過有限物種的可接受水平代表整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)，據(jù)此可推算出基準(zhǔn)閾值[32-33]. 目前，一般以保護(hù)95%生物的污染物濃度，即HC5 作為安全閾值[34]，HC5 除以一個(gè)評估因子(assessment factor, AF，取值范圍為1～5)即可得到水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)[35]. 該評估因子的選擇需要考慮數(shù)據(jù)質(zhì)量、毒性終點(diǎn)的選擇、數(shù)據(jù)所包含物種的多樣性和代表性、化學(xué)物質(zhì)的作用模式、統(tǒng)計(jì)過程的不確定性等. 然而，目前還沒有有效方法來定量這些不確定性，大部分研究中AF 取值為2[36]. 如張瑞卿等[37]推導(dǎo)無機(jī)汞的水質(zhì)基準(zhǔn)、Li等[38]推導(dǎo)鉛的水質(zhì)基準(zhǔn)以及Lei 等[39]推導(dǎo)4 壬基酚的水質(zhì)基準(zhǔn)時(shí)，均取2 作為AF 值. 因此，該文也選取2 作為AF 計(jì)算基準(zhǔn)閾值. 采用5 種分布模型擬合了SSD 曲線，發(fā)現(xiàn)5 種模型均能成功地?cái)M合兩組毒性數(shù)據(jù)(見圖2).

圖 1 不同濃度高效氟吡甲禾靈暴露對13 種本地海洋生物存活率的影響Fig.1 Effects of haloxyfop-P-methyl exposure on survival rates of 13 native marine organisms

圖 2 采用5 種模型構(gòu)建高效氟吡甲禾靈對水生生物毒性的物種敏感性分布(SSD)曲線Fig.2 Species sensitivity distribution (SSD) curves of haloxyfop-P-methyl toxicity to aquatic organisms calculated by 5 models

通過不同方法進(jìn)一步對毒性數(shù)據(jù)的擬合效果進(jìn)行檢驗(yàn)(見表4)，結(jié)果顯示，KS 和AD 檢驗(yàn)均大于0.05，AIC 和BIC 檢驗(yàn)結(jié)果比較接近. Guthery 等[22,40-42]推薦采用AICC 確定擬合效果最好的模型，即參數(shù)delta 為0. 該研究發(fā)現(xiàn)log-gumbel 檢驗(yàn)下delta 值為0，所以log-gumbel 模型更適合擬合該研究毒性數(shù)據(jù).

表 4 高效氟吡甲禾靈的水生生物急性毒性數(shù)據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of acute toxicity data of haloxyfop-P-methyl to aquatic organisms

該研究以log-gumbel 模型擬合了HPME 對水生生物的SSD 曲線(見圖3). 根據(jù)所得SSD 曲線可知，甲殼綱動物對HPME 較為敏感，相比之下藻類和軟體動物類群敏感度較低. 已有研究表明，與HPME 同為手性除草劑的苯醚甲環(huán)唑?qū)讱ぞV的生物毒性大于藻類[43]，這與該研究的結(jié)論一致.

圖 3 采用log-gumbel 模型構(gòu)建高效氟吡甲禾靈對水生生物毒性的物種敏感度分布(SSD)曲線Fig.3 Species sensitivity distribution (SSD) curves of haloxyfop-P-methyl toxicity to aquatic organisms calculated by log-gumbel models

根據(jù)擬合曲線，基于兩組毒性數(shù)據(jù)可得HPME的HC5 分別為74.1 和89.5 μg/L. 除以AF 因子得到HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)為37.05 μg/L，而基于7 種淡水+13 種海水生物毒性數(shù)據(jù)的水質(zhì)基準(zhǔn)為44.75 μg/L. 歐盟規(guī)定在推導(dǎo)海水水質(zhì)基準(zhǔn)時(shí)不嚴(yán)格排斥淡水生物的毒性數(shù)據(jù)，因此多將海水和淡水生物的毒性數(shù)據(jù)一并使用[44]. 我國海岸線較長，污染物出現(xiàn)短期高濃度暴露的情況多發(fā)生于河口、港區(qū)、沿岸工業(yè)/市政排污口等區(qū)域，這些區(qū)域棲息著廣鹽性的水生生物. 因此，推導(dǎo)我國海水水質(zhì)基準(zhǔn)的毒性數(shù)據(jù)應(yīng)包括海水和淡水生物的毒性數(shù)據(jù)[45]. 該文基于海水?dāng)?shù)據(jù)推導(dǎo)出HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)與基于海水及淡水?dāng)?shù)據(jù)所推導(dǎo)的HPME 水質(zhì)基準(zhǔn)相差不大. 因此，在推導(dǎo)芳氧苯氧丙酸酯類除草劑的海水水質(zhì)基準(zhǔn)時(shí)，可以采用淡水生物毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充.

2.3.2 SSR 法

對毒性數(shù)據(jù)的敏感度排序結(jié)果顯示，13 種海水生物的FAV 值為78.85 μg/L，除以AF 得出HPME 的水質(zhì)基準(zhǔn)為39.43 μg/L (見表5). 7 種淡水+13 種海水生物的FAV 值為83.30 μg/L，水質(zhì)基準(zhǔn)為41.65 μg/L，這與SSD 法推導(dǎo)的基準(zhǔn)值相差較小. SSR 法最終用于計(jì)算基準(zhǔn)值的只是4 個(gè)屬的毒性數(shù)據(jù)，最終的基準(zhǔn)值很大程度上依賴于敏感物種的數(shù)據(jù)，而SSD 法則更多依賴整體毒性數(shù)據(jù)[46]，可見該研究選取的物種對HPME 整體較為敏感.

表 5 物種敏感性排序法(SSR)推導(dǎo)高效氟吡甲禾靈對水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)的參數(shù)運(yùn)算Table 5 Parameter calculation for deriving quality criteria for haloxyfop-P-methyl to aquatic organisms by species sensitivity rank (SSR) method

3 結(jié)論

a) HPME 對13 種本地生物的LC50/EC50在0.103～47.111 mg/L 之間，安氏偽鏢水蚤為最敏感物種，牡蠣為最不敏感物種.

b) 基于該研究獲得的13 種海洋生物的毒性數(shù)據(jù)，利用SSD 法推導(dǎo)出HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)為37.05 μg/L，略低于基于所有毒性數(shù)據(jù)推導(dǎo)的水質(zhì)基準(zhǔn)(44.75 μg/L).

c) SSR 法推導(dǎo)出HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)為39.43 μg/L，而基于所有毒性數(shù)據(jù)推導(dǎo)的水質(zhì)基準(zhǔn)為41.65 μg/L.

d) 該文構(gòu)建了HPME 的水生生物毒性數(shù)據(jù)庫，推導(dǎo)出了HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)，為HPME 在我國海域開展互花米草的化學(xué)防治提供了可參考的生態(tài)安全閾值.