焦鄭同， 朱 琳， 鄒海明， 王 艷

(安徽科技學院 資源與環(huán)境學院，安徽 鳳陽 233100)

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)代化的快速發(fā)展,人類活動產(chǎn)生的污染物伴隨著降水、地表徑流等遷移到土壤當中,導致土壤中污染物的積累,造成了各種土壤環(huán)境問題[1]。其中,最為顯著的就是重金屬污染問題,全球范圍內(nèi)多種重金屬元素的平均排放水平嚴重超標,重金屬污染情況極其嚴峻[2-3]。歐盟的農(nóng)業(yè)用地中有超過1 370萬公頃的土地遭受不同程度的重金屬污染并亟需治理。目前,我國土壤重金屬污染情況十分嚴峻,自然資源部報告稱,截至2020年,我國重金屬污染土壤已達2 000萬公頃左右,占耕地面積的10%以上。由于重金屬在土壤中具有滯后性、累積性、不可逆性、長期性及毒害性等特點[4],富集在土壤中的重金屬無法降解,對土壤功能、人類身體健康等構成嚴重的威脅[5]。盡管重金屬因其自身特性,在土壤中遷移性較差,但經(jīng)過雨水的洗滌會隨著水流進入地表徑流或地下水,形成面源污染,對生態(tài)功能結構以及人類的身體健康產(chǎn)生危害[6-7]。因此,如何有效修復重金屬污染的土壤已成為環(huán)境研究領域的熱點[8]。

植物修復是一種通過植物對土壤中重金屬的固定、吸收等作用對污染土壤進行修復的一種技術,因其成本效益及環(huán)境友好性被科學界認可。在選擇重金屬污染修復所用植物時,應根據(jù)污染區(qū)域的具體情況,篩選在重金屬污染區(qū)域受毒害影響不明顯、對重金屬擁有較強富集能力的植物[9]。超積累植物(hyperaccumulator)是指地下部分可從土壤中吸收超量的重金屬,并將其轉移到地上部分,地上部分所含重金屬超過一般植物地上部分100倍以上[10]。但是受到超積累植物其本身生物量和生長周期等因素的制約,植物修復需要漫長的過程,其大規(guī)模應用有待進一步的研究[11-12]。因此,如何提高植物修復的效率是使用植物修復技術來進行污染土壤修復亟待解決的問題。

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指生活在土壤或定殖于植物根際,并通過分泌植物激素、鐵載體等方式促進植物生長、增強植物抗逆性的有益菌[13]。根際促生菌可以增加ACC脫氨酶的活性,分解在逆境中植物產(chǎn)生的乙烯合成前體ACC,降低乙烯的濃度,從而緩解植物的不良反應[14]。同時根際促生菌液可以分泌生長素IAA、赤霉素GA等多種植物激素來促進植物生長[15]。Ahmad等[16]研究發(fā)現(xiàn),根瘤菌及假單胞菌混合接種可提高綠豆光合作用率、水的利用效率以及葉綠素含量,降低高鹽度對植株生長的不利影響,促進綠豆植株生長、提高果實質(zhì)量。Lim等[17]等研究發(fā)現(xiàn),接種PGPR菌株地衣芽孢桿菌K11的胡椒植株耐受干旱脅迫的能力增強。劉東昀等[18]篩選出根際促生菌-Enterobactersp.EG16,該菌能分泌鐵載體,緩解鎘對植物的脅迫,并能促進植物生長。Bacillussp.E5與叢枝菌根真菌共同接種會增加生菜的抗旱能力。

微生物-植物聯(lián)合修復是目前提高植物修復效率最主要的方法,近年來發(fā)展迅速[19]。研究表明,植物與微生物共存能增強植物的重金屬抗性,擁有較理想的修復效果[20]。一方面,部分微生物可促進植物的生長,增強植株抗逆性;另一方面,植物在抗重金屬過程中也能提高這些微生物的抗重金屬能力[21],使微生物在重金屬脅迫條件下仍能存活,并發(fā)揮促進植株生長、增強植株抗逆性的作用。盧琪等[22]研究發(fā)現(xiàn)樊慶生紅球菌對于超積累植物東南景天修復重金屬污染土壤方面具有顯著性的有益效果。Hassan等[23]研究發(fā)現(xiàn),根際細菌菌株AN8可以顯著的減少鉛污染的毒害效果。Grobelak等[24]研究發(fā)現(xiàn)根際促生細菌Agrostiscapillari在 Pb、Zn、Cd等混合重金屬脅迫條件下,能顯著提高油菜花的存活率。

本研究通過盆栽實驗研究根際促生菌(樊慶生紅球菌,Rhodococcusqingshengii)與超積累植物黑麥草聯(lián)合修復重金屬鉛污染土壤的能力,旨在為利用黑麥草進行重金屬污染土壤的修復及后續(xù)應用提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為安徽科技學院資源與環(huán)境學院實驗室保存的Rhodococcusqingshengii(樊慶生紅球菌)。從-80 ℃冰箱取出甘油保存的菌株后,于LB(Luria-Bertan)培養(yǎng)基中活化。活化至第二代后取1 mL接種于50 mL無菌LB液體培養(yǎng)基于恒溫震蕩箱(轉速200 r/min,溫度30 ℃)中培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)后的菌液于高速冷凍離心機中離心,離心速度3 000 r/min,離心時間10 min收獲菌體,并用0.9%無菌生理鹽水洗滌3次,使用無菌生理鹽水溶解為菌懸液。通過紫外可見光光度法測定菌懸液濃度。本研究中菌懸液吸光度為0.177。

供試植株為一年生黑麥草,種子購買于浙江寧波某種業(yè)公司。播撒前,使用75%乙醇溶液表面消毒15 min,并用無菌水沖洗3次。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗組處理以及對照組設置 使用營養(yǎng)土種植黑麥草進行室內(nèi)培養(yǎng)試驗,共設置6個處理,分別為：土壤中不含外源鉛不接種菌液(CK)、土壤中不含外源鉛接種菌液(CK+R)、模擬農(nóng)業(yè)污染土壤不接種菌液(C1)、模擬農(nóng)業(yè)污染土壤接種菌液(C1+R)、模擬林業(yè)污染土壤不接種菌液(C2)、模擬林業(yè)污染土壤接種菌液(C2+R),每個處理9次重復。其中模擬林業(yè)污染土壤中Pb的終濃度為4 689.45 mg/kg,模擬農(nóng)業(yè)鉛污染土壤中Pb的終濃度為745.98 mg/kg。每個實驗組含營養(yǎng)土395 g,放置4個月老化穩(wěn)定后用于實驗。

1.2.2 植物的培養(yǎng) 將一年生黑麥草種子均勻播撒于土壤表面中,在種子上覆一層薄土,澆水50 mL。每盆樣品100粒種子。在植物生長期間,每隔一段時間用等量超純水澆灌生長基質(zhì),以保持土壤濕潤。

1.2.3 根際微生物施加 在黑麥草生長兩周后,向預接種樊慶生紅球菌的實驗組(CK+R、C1+R、C2+R)中施加40 mL菌懸液。向未接種樊慶生紅球菌的實驗組(CK、C1、C2)澆灌40 mL生理鹽水。

1.2.4 樣品采集 黑麥草在根際接種菌液生長2周后,收獲植物,盡量保持黑麥草根系的完整,用去離子水沖洗后,觀察、測量。

1.3 測定項目及分析方法

黑麥草樣品進行重金屬含量測定前,將分離的黑麥草地上部與地下部洗凈后分別裝入信封,使用烘箱105 ℃殺青30 min,75 ℃烘干至恒重后磨成粉末過篩裝入密封袋備用。

使用微波消解法[25]處理樣品，將聚四氟乙烯消化管在鹽酸溶液中浸泡12 min,清洗干凈用超純水潤洗、烘干,向各個消化管內(nèi)加入0.1 g研磨后過篩的樣品,然后加入10 mL濃硝酸、3 mL濃鹽酸、2 mL氫氟酸。將聚四氟乙烯消化管放入微波消解爐中,使用扳手固定,消解50 min。消解完成后取出消化管,待其冷卻至室溫,向消化管中加入2 mL雙氧水放入趕酸儀中進行趕酸。溫度設置為170 ℃,待消化管中剩下2 mL以下的溶液后,趕酸完成。取出消化管,冷卻至室溫后,將消化管中的液體倒入25 mL比色管中,用1%的稀硝酸潤洗消化管并定容至25 mL,過濾后用于ICP-OES(電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀)上機測定。

吸取1 000 μg/mL鉛標液定容,使標線濃度達到1、5、10、15、20 μg/mL,用于ICP-OES標準曲線的繪制,并使用ICP-OES對消解后的樣品進行測定。

2 結果與分析

2.1 黑麥草生長情況變化

黑麥草生長狀況如圖1所示,CK、CK+R、C1、C1+R組黑麥草地上部無明顯差異,與CK、CK+R相比,C2、C2+R實驗組的地上部長度為對照的84.7%、77.8%?？梢姺畱c生紅球菌的施加對于植物的生長無負面影響,且黑麥草在鉛脅迫環(huán)境中抗逆性較強。將C2+R與C2對比,C2+R組黑麥草地上部長度僅為C2的88.5%,在接種菌液后黑麥草地上部生長受到抑制,這與王元昌等[14]亞麻接種根際促生菌富集鎘砷地上部分生長受抑制結果相同。

接種了樊慶生紅球菌的CK+R、C1+R、C2+R實驗組地下部與未接種的CK、C1、C2實驗組相比增幅18.5%、15.3%、22.4%,說明樊慶生紅球菌擁有促進植物地下部生長的作用,提高了植物的抗逆性。與李靖等[26]根際促生菌增強巨菌草地下部生長結果相同。與吳慧麗等[27]將根際促生菌接種至黑麥草根系,黑麥草株高增加結果相同。與C2相比C2+R組根部受到促進,表明在高鉛脅迫的林業(yè)土壤中樊慶生紅球菌仍能存活,并起到增強植物抗逆性的作用。將C1、C1+R與CK、CK+R相比可發(fā)現(xiàn)C1、C1+R實驗組黑麥草地下部長度為空白對照組的96%、93.8%,將C2、C2+R實驗組與CK、CK+R相比可發(fā)現(xiàn),C2、C2+R的地下部長度僅為空白對照的82.7%、85.4%,結果表明樊慶生紅球菌對黑麥草地下部生長的促進效果與重金屬Pb含量成反比。接種微生物后生物量有明顯增加,說明微生物能有效緩解 Pb對植株的毒害,提高植株抗逆性,使植株可正常生長,這與張勝爽[28]研究結果一致。

接種樊慶生紅球菌促進了黑麥草地下部分的生長,但其地上部分無明顯變化甚至受到抑制(圖1),這可能一方面是實驗時間較短,地下部分未生長至最終形態(tài),對養(yǎng)分消耗較大,使得葉片無法吸收足夠的養(yǎng)分生長。另一方面根際促生菌促進地下部分生長后,地下部分在吸收養(yǎng)分的同時對重金屬起到了超量富集的作用,鉛的脅迫使得黑麥草葉片無法良好生長。

圖1 黑麥草生長狀況

2.2 植株各部位重金屬含量結果分析

黑麥草地上部重金屬含量的變化情況見表1,在模擬農(nóng)田鉛污染土壤修復實驗組中,C1+R組黑麥草地上部鉛含量與C1相比明顯增加,增長率為104%。在模擬林業(yè)鉛污染土壤修復組中,將C2+R與C2相比,可發(fā)現(xiàn)黑麥草地上部鉛含量存在一定程度的增長,增長率為30%。結果表明接種樊慶生紅球菌后黑麥草地上部重金屬鉛含量顯著增加,這說明根際接種樊慶生紅球菌對植株富集重金屬鉛有著促進作用,可以提高植株修復重金屬污染土壤的效率,但接種樊慶生紅球菌對黑麥草吸收重金屬鉛的促進作用隨著土壤中重金屬含量的增長緩慢降低,說明黑麥草富集的重金屬鉛對于黑麥草的生長存在毒害作用,但黑麥草自身抗鉛脅迫能力較強,同時接種樊慶生紅球菌后增強了黑麥草抗逆性,確定了樊慶生紅球菌-黑麥草聯(lián)合修復重金屬污染土壤是一條可行的道路。

黑麥草地下部鉛含量如表1所示,在模擬農(nóng)田鉛污染土壤修復組中,與C1相比,C1+R的地下部鉛含量增幅為2.3%。在模擬林業(yè)鉛污染土壤修復組中,與C2相比,C2+R的地下部鉛含量增幅為2.2%。結合表1地上部鉛含量可知,雖然接種樊慶生紅球菌后黑麥草地下部鉛含量增長率較低,但黑麥草地下部鉛含量遠高于地上部鉛含量,說明黑麥草富集重金屬鉛的主要部位為地下部。本試驗中,接種樊慶生紅球菌后能增加一年生黑麥草的鉛含量,這一現(xiàn)象可以解釋為,一方面接種樊慶生紅球菌促進黑麥草地下部生長,從而強化黑麥草對重金屬的富集能力,另一方面樊慶生紅球菌接種活化土壤中的鉛,促進了黑麥草對鉛的吸收,進一步導致了鉛的高積累。與孫楠等[29]接種根際微生物,致使桂花和梔子花體內(nèi) 鉛、Cd 含量隨外源重金屬添加量增加而增加,均表現(xiàn)為地下部高于地上部結果相同。

表1 黑麥草植株Pb含量

3 結論

本實驗通過樊慶生紅球菌與黑麥草聯(lián)合修復技術對鉛污染土壤進行修復,得到以下結論:

(1)在相同培養(yǎng)條件下,相較于對照組CK,CK+R處理組中黑麥草長勢未有明顯變化,說明接種菌液對黑麥草的生長無負面影響。C1、C1+R模擬農(nóng)田污染處理組與對照組CK相比,地上部分無明顯變化。而比較模擬林業(yè)污染土壤(C2、C2+R處理組)與對照組(CK、CK+R),可發(fā)現(xiàn)高濃度鉛污染將對黑麥草的生長產(chǎn)生一定程度的抑制。比較模擬林業(yè)污染土壤中C2+R處理組與C2,可發(fā)現(xiàn)在接種菌液后,由于黑麥草富集了過量重金屬,導致其地上部生長受到一定程度的抑制。

(2)在相同培養(yǎng)條件下,相較于CK、C1、C2的實驗組,根際接種樊慶生紅球菌的處理組CK+R、C1+R、C2+R中,黑麥草地下部的生長明顯受到促進,增長率分別為18.5%、15.3%、22.4%。說明樊慶生紅球菌有助于地下部的生長,有利于植株從土壤中吸收養(yǎng)分、富集重金屬,對植株在逆境中的生長有著積極的促進作用。

(3)在模擬農(nóng)業(yè)土壤中,根際接種樊慶生紅球菌的黑麥草(C1+R)植株地上部及地下部鉛含量與未接種菌液的處理組(C1)相比,分別增加了104%、2.3%。在高污染的林業(yè)土壤中,C2+R實驗組地上部、地下部與C2實驗組相比,鉛含量分別增加了30.25%、2.2%。說明根際施加樊慶生紅球菌有利于黑麥草對于重金屬鉛的富集。

綜上所述,樊慶生紅球菌促進了黑麥草對于重金屬鉛的吸收,樊慶生紅球菌-黑麥草聯(lián)合修復技術可以用于修復鉛污染土壤,為土壤重金屬污染修復提供新方法,并為微生物菌劑的研發(fā)提供新思路。