王 艷， 劉 暢,*， 靳二輝， 趙 磊，胡倩倩， 路振香， 李 磊

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬肉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽(yáng) 233100; 3.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的快速發(fā)展，環(huán)境鎘污染日益嚴(yán)重。目前，我國(guó)多地均存在著不同程度的鎘污染問題[1]。土壤鎘污染直接導(dǎo)致地下水、糧食、牧草及農(nóng)作物中的鎘含量超標(biāo)，從而導(dǎo)致飼料及其原料中鎘嚴(yán)重超標(biāo)[2]。農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心實(shí)驗(yàn)室承檢的飼料添加劑樣品中鎘含量大幅超標(biāo)，最高達(dá)8.4%；在貴州某污染區(qū)，飼料中鎘含量達(dá)我國(guó)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》限量的13.16倍；徐喆[3]研究發(fā)現(xiàn)，黑龍江省某市雞配合飼料中鎘的總體超標(biāo)率達(dá)7.1%。動(dòng)物采食被污染飼料可造成急、慢性中毒，嚴(yán)重影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，更令人擔(dān)憂的是鎘還可以通過食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重危害人畜健康。

鎘為人和動(dòng)物非必需元素[4]，可經(jīng)皮膚、呼吸道及消化道吸收進(jìn)入體內(nèi)[5]，消除半衰期可長(zhǎng)達(dá)10～30年之久，一經(jīng)進(jìn)入機(jī)體，幾乎無法被釋放出體外[6]。進(jìn)入體內(nèi)的鎘可對(duì)肝、腎、肺、骨骼和腦等主要器官形成損害[7-8]，也可導(dǎo)致免疫、神經(jīng)、生殖等系統(tǒng)的損傷[9]。肝臟具有分泌膽汁、參與物質(zhì)與能量代謝、吞噬、解毒和防御等多重生理功能。肝功能的復(fù)雜性和多樣性增加了肝臟與各種毒性因子接觸的機(jī)會(huì)，因此，肝臟最易受到各種致病因素的侵害而造成損傷。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟是鎘的主要靶器官之一，鎘吸收進(jìn)入血液循環(huán)后快速到達(dá)肝臟，在肝臟中進(jìn)行蓄積，人體內(nèi)大約1/6的鎘蓄積于肝臟[10]，急性或高劑量鎘中毒主要表現(xiàn)為急性肝損傷[11]。鎘暴露還與多種癌癥的發(fā)生相關(guān)，特別是與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[12]。通常認(rèn)為，鎘誘導(dǎo)的急性肝損傷與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于鎘誘導(dǎo)肝損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明，這對(duì)鎘暴露肝損傷的防治工作帶來巨大挑戰(zhàn)，因此，深入揭示鎘誘導(dǎo)肝損傷作用機(jī)制具有重要理論意義與臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究通過建立體外鎘誘導(dǎo)肝損傷模型并分析鎘誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激損傷作用，為進(jìn)一步深入揭示鎘誘導(dǎo)的肝損傷作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

正常小鼠胚胎肝細(xì)胞(BNL CL.2)由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)/干細(xì)胞庫(kù)提供；CdCl2、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(pH7.4，PBS)與0.25%胰蛋白酶均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；總超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒、CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒與Hoechst 33342染液等購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常小鼠胚胎肝細(xì)胞(BNL CL.2)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖的培養(yǎng)基當(dāng)中，在37 ℃、含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，再經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，加入新鮮的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液后，按照1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8法測(cè)定鎘對(duì)BNL CL.2細(xì)胞的毒性作用 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BNL CL.2細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種至96孔板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，濃度為0～80 μmol/L的CdCl2處理0～24 h，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于試驗(yàn)結(jié)束前3 h在每孔加入CCK-8試劑10 μL，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采用酶標(biāo)儀(Multiskan GO1510，Thermo Fisher公司)于450 nm 處測(cè)定吸光度，并計(jì)算各處理組細(xì)胞存活率。

1.2.3 HE染色 使用40 μmol/L CdCl2分別處理細(xì)胞0、3、6、12、18、24 h后，用PBS輕輕洗滌3次，使用95%酒精固定13 min，然后用PBS洗2次，每次1 min，接著使用蘇木素染液染色10 min，自來水洗3遍后，浸入1%鹽酸-酒精溶液分色數(shù)秒，然后再用自來水浸洗3遍，隨后用伊紅染液復(fù)染12 min，自來水浸洗后進(jìn)行拍照分析。

1.2.4 Hoechst 33342染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BNL CL.2細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，經(jīng)40 μmol/L CdCl2分別處理0、3、6、12、18、24 h后，每個(gè)培養(yǎng)皿加入1.5 mL Hoechst 33342細(xì)胞染液，37 ℃避光條件下孵育10 min；然后棄掉染液，加入少量PBS緩沖液輕輕洗滌2次后，使用倒置熒光顯微鏡(T12-U+Q12，尼康)觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.5 CdCl2對(duì)BNL CL.2細(xì)胞SOD活力的影響 BNL CL.2細(xì)胞經(jīng)40 μmol/L CdCl2分別處理0、3、6、12、18、24 h后，按照SOD檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定各組樣品中SOD的活力，以BCA法測(cè)定各組樣本的蛋白濃度，并根據(jù)樣品蛋白濃度校正各組SOD測(cè)定結(jié)果。

1.2.6 CdCl2對(duì)BNL CL.2細(xì)胞MDA含量的影響 BNL CL.2細(xì)胞經(jīng)40 μmol/L CdCl2作用不同時(shí)間后，按照試劑盒說明書測(cè)定各組樣品中MDA的含量，并根據(jù)各組樣品蛋白濃度校正測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的CdCl2對(duì)小鼠肝細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)定不同濃度CdCl2對(duì)BNL CL.2細(xì)胞活力的影響。結(jié)果如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，40 μmol/L和80 μmol/L CdCl2處理12 h可極顯著抑制BNL CL.2細(xì)胞活力(P<0.01)，而10 μmol/L和20 μmol/L對(duì)BNL CL.2細(xì)胞活力無顯著影響(P>0.05)，因此，在后續(xù)研究中選擇40 μmol/L CdCl2作為處理因素。

圖1 不同濃度CdCl2對(duì)小鼠肝細(xì)胞活力的影響

2.2 CdCl2不同作用時(shí)間對(duì)小鼠肝細(xì)胞活力的影響

以40 μmol/L CdCl2分別處理BNL CL.2細(xì)胞0、3、6、12、18、24 h，然后采用CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2所示，40 μmol/L CdCl2作用BNL CL.2細(xì)胞6 h可顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，作用12 h后可極顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.01)。

圖2 CdCl2作用不用時(shí)間對(duì)小鼠肝細(xì)胞活力的影響

2.3 HE染色

如圖3所示，40 μmol/L CdCl2處理小鼠肝細(xì)胞3和6 h后，少量細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，處理12 h后，肝細(xì)胞空泡變性明顯加重，細(xì)胞核固縮，部分細(xì)胞腫脹、死亡，上述病理變化在18和24 h處理組中更加明顯。以上結(jié)果表明40 μmol/L CdCl2對(duì)小鼠肝細(xì)胞可造成嚴(yán)重的損傷作用，該損傷作用會(huì)隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而加劇。

圖3 HE染色法觀察CdCl2對(duì)小鼠肝細(xì)胞的損傷作用

2.4 Hoechst 33342染色

40 μmol/L CdCl2分別處理BNL CL.2細(xì)胞0、3、6、12、18、24 h，然后用Hoechst 33342染液染色，倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞核的病理變化情況。結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，CdCl2作用3 h后逐漸開始出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮、斷裂等情況，隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞核濃縮、斷裂的比例逐漸增加。

圖4 Hoechst 33342染色結(jié)果

2.5 CdCl2對(duì)小鼠肝細(xì)胞SOD活力的影響

如圖5所示，與空白對(duì)照組相比，40 μmol/L CdCl2作用于小鼠肝細(xì)胞6 h后，細(xì)胞SOD的活力極顯著降低(P<0.01)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，SOD活力進(jìn)一步受到抑制，表明肝細(xì)胞抗氧化能力受到了一定的抑制作用。

圖5 CdCl2對(duì)小鼠肝細(xì)胞SOD活力的影響

2.6 CdCl2對(duì)小鼠肝細(xì)胞MDA含量的影響

與空白對(duì)照組相比，40 μmol/L CdCl2作用于小鼠肝細(xì)胞6 h后，細(xì)胞MDA含量極顯著升高(P<0.01)，但隨著CdCl2作用時(shí)間延長(zhǎng)，MDA含量逐漸降低，染毒18 h后，細(xì)胞內(nèi)MDA含量與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

圖6 CdCl2對(duì)小鼠肝細(xì)胞MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

鎘作為常見的環(huán)境污染物，其誘導(dǎo)的肝損傷作用通常與氧化應(yīng)激及其伴隨的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，40 μmol/L CdCl2作用6 h即可導(dǎo)致BNL CL.2細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05)，隨著CdCl2作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活力進(jìn)一步受到抑制。通過HE染色和Hoechst 33342染色發(fā)現(xiàn)，CdCl2作用6 h后，細(xì)胞形態(tài)即開始出現(xiàn)核濃縮、空泡變性等病理變化，當(dāng)CdCl2作用時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)后，細(xì)胞空泡變性與核濃縮情況也隨之加重，這提示40 μmol/L CdCl2作用6 h后即可造成BNL CL.2細(xì)胞損傷。同時(shí)，BNL CL.2細(xì)胞經(jīng)40 μmol/L CdCl2處理6 h后，SOD活力即受到極顯著抑制(P<0.01)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，SOD受到進(jìn)一步抑制。然而，MDA在CdCl2處理6 h后顯著升高(P<0.01)，但隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)MDA含量逐漸恢復(fù)正常。

正常情況下，體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)常處于動(dòng)態(tài)平衡之中，從而維持機(jī)體的新陳代謝[13]。當(dāng)受到外來物質(zhì)刺激后，機(jī)體氧化與抗氧化平衡可被打破，此時(shí)，生物膜內(nèi)不飽和脂肪酸因受到自由基攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，其產(chǎn)物MDA具有明顯的細(xì)胞毒性，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)[14]。本研究中，CdCl2處理的BNL CL.2細(xì)胞MDA含量顯著升高，表明鎘可導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，這與張文華等報(bào)道的結(jié)果一致[15]，但在本研究中，當(dāng)CdCl2作用18～24 h，MDA含量盡管依然高于空白對(duì)照組，但與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，這可能與細(xì)胞中MDA含量相對(duì)較低，導(dǎo)致組內(nèi)變異系數(shù)較大而導(dǎo)致組間差異不顯著。SOD能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和H2O2，其中H2O2可經(jīng)過氧化氫酶催化生成H2O，從而保護(hù)機(jī)體免受自由基的氧化損傷[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CdCl2處理BNL CL.2細(xì)胞6 h即可顯著抑制SOD的活力，造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，SOD可被進(jìn)一步抑制，這與本課題組前期體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果一致[18]。研究表明，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，SOD活力會(huì)顯著降低，而MDA含量則升高，細(xì)胞死亡率顯著升高[19]。陳嘉興等[20]研究發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L鎘作用48 h可致HEK細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞SOD的活性顯著降低，同時(shí)MDA含量顯著升高，這與本研究結(jié)果一致。

綜上，本研究成功制備了鎘誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷體外模型，證實(shí)鎘可誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，為深入探討鎘的肝細(xì)胞毒性提供了研究基礎(chǔ)。