陸 寧， 張慧敏， 邢 爽， 丁德杰，陳 鑫， 高 瑾， 張 潮， 蒲順昌*

(1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；2.藥食同源功能食品亳州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 亳州 236800)

諾氟沙星(Norfloxacin, NFLX)別名氟哌酸,化學(xué)名稱為1-乙基-6-氟-1,4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3喹啉羧酸,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示,屬于第三代喹諾酮類抗菌藥物,為灰白色至淡黃色結(jié)晶粉末[1-2]。NFLX殺菌效果好,能夠抑制消化道內(nèi)致病細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶作用,阻礙致病菌DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和重組,對(duì)細(xì)菌有較好的抑制作用[3-4]。但NFLX也具有一定的毒副作用,會(huì)引起過敏反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、消化系統(tǒng)損傷、泌尿系統(tǒng)損傷、心血管系統(tǒng)損傷等,還會(huì)破壞人體內(nèi)的菌群平衡,人體長(zhǎng)期攝入含有NFLX的食品,會(huì)導(dǎo)致NFLX在人體內(nèi)積累,對(duì)人們的健康造成潛在威脅,嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)危害生命[5-6]。我國(guó)規(guī)定動(dòng)物源性食品中諾氟沙星的限量標(biāo)準(zhǔn)為不得超過10 ng/mL[7]。有些不法商販會(huì)將NFLX作為蜂藥、獸藥等用于蜜蜂、畜禽、漁業(yè)養(yǎng)殖,長(zhǎng)期使用會(huì)使蜂蜜、畜禽、水產(chǎn)體內(nèi)存有大量NFLX殘留,嚴(yán)重威脅人類健康[8]。因此,諾氟沙星的檢測(cè)越來越引起人們的重視。

圖1 諾氟沙星化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前,針對(duì)諾氟沙星的檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法(Capillary electrophoresis,CE)、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、液相質(zhì)譜法(Liquid Mass Spectrometry,MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等[9-12]。其中,HPLC、MS和LC-MS檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高,但是操作步驟繁瑣,對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)的要求高,多用于檢測(cè)部門少量精確樣品檢測(cè)[13]。CE方法靈敏度不高、選擇性較低,現(xiàn)階段運(yùn)用該方法進(jìn)行檢測(cè)的情況不多[14]。ELISA具有靈敏度高、快速穩(wěn)定、特異性好、成本低、樣品前期處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn),是目前高通量檢測(cè)使用最為廣泛的檢測(cè)方法[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)將NFLX與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián),制備免疫原免疫新西蘭大白兔,從新西蘭大白兔體內(nèi)分離純化得到高特異性的NFXL抗體,并通過ELISA對(duì)抗原抗體結(jié)合性能進(jìn)行優(yōu)化,開發(fā)出一種高靈敏度的諾氟沙星廣譜特異性快速檢測(cè)方法。同時(shí),對(duì)抗原抗體的識(shí)別機(jī)制進(jìn)行初步探討,為高靈敏度抗體的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司);氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司);N-羰基琥鉑酰亞胺(NHS)(美國(guó)Sigma公司);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)(美國(guó)Sigma公司);N,N-二甲基酰胺(DMF)(美國(guó)Sigma公司);牛血清蛋白(BSA)(美國(guó)Sigma公司);雞卵血清蛋白(OVA)(美國(guó)Sigma公司);氯甲酸異丁酯(美國(guó)Sigma公司);三正丁胺(美國(guó)Sigma公司);弗氏完全佐劑(美國(guó)Sigma公司);弗氏不完全佐劑(美國(guó)Sigma公司);正辛酸(分析純,廣州臺(tái)山粵橋化工廠);硫酸銨(分析純,廣州臺(tái)山粵橋化工廠);氫氧化鈉(分析純,廣州臺(tái)山粵橋化工廠);脫脂奶粉(食用級(jí),安怡公司);酶標(biāo)二抗(美國(guó)Bioworld公司);TMB顯色液(實(shí)驗(yàn)室配制);吐溫-20(北京索萊寶科技有限公司);魚肉、蜂蜜(當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買);PBS緩沖液(實(shí)驗(yàn)室配制);碳酸鹽緩沖液(實(shí)驗(yàn)室配制)。

1.2 儀器與設(shè)備

ME3002E電子天平(美國(guó)Mettler toledo公司);ME204電子天平(美國(guó)Mettler toledo公司);超純水制作儀(蘇州賽恩斯儀器有限公司);4 ℃/-20 ℃冰箱(中國(guó)海爾公司);ND1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司);QL-861振蕩器(海門市其林貝爾儀器有限公司);6K15冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sartorius-Sigma公司);M2E多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular device公司);DHG-9145電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海恒一科技有限公司);DK-8D電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人工抗原的制備與鑒定 采用活潑酯法,將NFLX標(biāo)準(zhǔn)品或氧氟沙星(OFL)標(biāo)準(zhǔn)品與BSA或OVA進(jìn)行偶聯(lián),得到目標(biāo)偶聯(lián)產(chǎn)物NFLX-BSA、NFLX-OVA、OFL-OVA,于-20 ℃分裝保存[17]。

使用紫外分光光度計(jì)對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物、BSA、OVA、NFLX標(biāo)準(zhǔn)品和OFL標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,獲得紫外吸收光譜,鑒定半抗原與載體蛋白是否偶聯(lián)成功。

1.3.2 動(dòng)物免疫 選用健康成年新西蘭大白兔進(jìn)行免疫。取50 μL 1 mg/mL的免疫原NFLX-BSA與等量弗氏完全佐劑混合進(jìn)行乳化,制備完全抗原。采用皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫,每只免疫350 μL劑量。3周后,取相同劑量的免疫原與等量的弗氏不完全佐劑混合進(jìn)行乳化,采用相同方式進(jìn)行第2次免疫,劑量不變。后續(xù)免疫均采用弗氏不完全佐劑進(jìn)行混合乳化,每隔3周進(jìn)行1次免疫。第4次免疫后10 d采血,混入等體積甘油,于-20 ℃?zhèn)浯妗?/p>

1.3.3 多克隆抗體的純化 取兔抗血清在4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min,將1 mL上清液與2 mL醋酸鹽緩沖液混合,pH調(diào)至4.8,室溫下充分?jǐn)嚢?。向反?yīng)液中逐滴加入75 μL正辛酸,室溫?cái)嚢?0 min,4 ℃下靜置2 h。4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min。上清液經(jīng)125 μm尼龍網(wǎng)進(jìn)行過濾,加入PBS緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.4)。用2 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.4。冰浴下于30 min內(nèi)向反應(yīng)溶液中加入0.28 g/mL硫酸銨,使其成為45%飽和溶液,4 ℃靜置1 h以上,12 000 r/min離心15 min,棄上清液,沉淀用PBS緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.4)透析3 d,得到的純化抗體在-20 ℃條件下保存。

1.3.4 兔多克隆抗體性能檢測(cè) 將同源包被原(NFLX-OVA)與異源包被原(OFL-OVA)分別用包被液(碳酸鹽緩沖液)稀釋至1 μg/mL后,向96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μL,37 ℃水浴過夜。利用制備好的酶標(biāo)板,采用ELISA方法對(duì)比同源、異源包被的檢測(cè)結(jié)果,篩選性能較好的包被原及抗體[18]。

1.3.5 適宜包被濃度及一抗稀釋倍數(shù)的確定 使用方陣滴定法,將包被原OFL-OVA濃度設(shè)置6個(gè)梯度,分別為1 000、500、250、125、62.5、31.25 ng/mL,抗體稀釋倍數(shù)設(shè)置8個(gè)梯度,分別為250、500、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000倍,進(jìn)行ELISA反應(yīng)操作,計(jì)算每個(gè)包被原濃度與抗體稀釋倍數(shù)組合的抑制率,確定最適宜的包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)。設(shè)置酶聯(lián)免疫反應(yīng)參數(shù)為:一抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間40 min,二抗稀釋倍數(shù)為5 000倍,二抗反應(yīng)時(shí)間30 min,稀釋液體系為PBST溶液。得出A450、IC50以及A450/IC50數(shù)量關(guān)系,篩選最優(yōu)包被濃度和一抗稀釋倍數(shù)。

1.3.6 二抗稀釋倍數(shù)的確定 設(shè)置酶聯(lián)免疫反應(yīng)參數(shù)為:包被濃度125 ng/mL,一抗稀釋倍數(shù)為500,一抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間40 min,二抗反應(yīng)時(shí)間30 min,稀釋液體系均為PBST溶液。二抗稀釋倍數(shù)設(shè)置2個(gè)水平,分別為5 000倍和10 000倍。ELISA反應(yīng)得到A450、IC50以及A450/IC50數(shù)量關(guān)系,確定最佳二抗稀釋倍數(shù)。

1.3.7 二抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的確定 設(shè)置酶聯(lián)免疫反應(yīng)參數(shù)為:包被濃度125 ng/mL,一抗稀釋倍數(shù)為500,一抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間40 min,二抗稀釋倍數(shù)為5 000,稀釋液體系均為PBST溶液。二抗反應(yīng)時(shí)間設(shè)置3個(gè)水平,分別為20、30、40 min進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn),得出A450、IC50以及A450/IC50數(shù)量關(guān)系,確定最佳二抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)前面的結(jié)果,以最優(yōu)工作條件進(jìn)行ELISA反應(yīng),建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,并利用Origin 8.5的四參數(shù)擬合模塊sigmoidal-logistic進(jìn)行擬合。

1.3.9 交叉反應(yīng) 將NFLX和馬波沙星、莫西沙星、吡哌酸、萘啶酸、蘆氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、普盧利沙星等8種氟喹諾酮類藥物在相同條件下分別進(jìn)行ELISA測(cè)定,計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50值,以NFLX的交叉反應(yīng)率(cross-reactivity,CR)為基準(zhǔn)(100%),檢測(cè)9種結(jié)構(gòu)交叉反應(yīng)情況。

CR=IC50(NFLX)/IC50(其余結(jié)構(gòu))×100%

1.3.10 回收試驗(yàn) 將1 g魚肉組織切碎,置于15 mL離心管中,加入2 mL三氯乙酸(7.5% TCA),渦旋混勻2 min,4 ℃ 5 000 r/min離心10 min,PBST稀釋50倍得到魚肉樣。蜂蜜用PBST稀釋50倍得到蜂蜜樣。向魚肉樣和蜂蜜樣中各添加50、100、500、1 000 ng/g的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品,按照ELISA步驟測(cè)定,每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)重復(fù),計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

NFLX、BSA和NFLS-BSA的紫外掃描結(jié)果如圖2所示,NFLX在波長(zhǎng)為210 nm和260 nm處有吸收峰,BSA在波長(zhǎng)為280 nm處有吸收峰,NFLX和BSA載體蛋白偶聯(lián)后,NFL-BSA的吸收峰向左發(fā)生偏移,說明偶聯(lián)物已經(jīng)偶聯(lián)成功。

圖2 NFLX、BSA和NFLX-BSA紫外光譜掃描曲線

NFLX、OVA和NEFX-OVA的紫外掃描結(jié)果圖3所示,NFLX在波長(zhǎng)為210 nm和260 nm處有吸收峰,OVA在280 nm處有吸收峰,NFLX和OVA載體蛋白偶聯(lián)后,NFL-OVA的吸收峰向左發(fā)生偏移,說明偶聯(lián)物已經(jīng)偶聯(lián)成功。

圖3 NFLX、OVA和NFLX-OVA紫外光譜法掃描曲線

OFL、OVA和OFL-OVA的紫外掃描結(jié)果如圖4所示,OFL在波長(zhǎng)為220 nm和260 nm處有吸收峰,OVA在280 nm處有吸收峰,OFL和OVA載體蛋白偶聯(lián)后,OFL-OVA的吸收峰向左發(fā)生偏移,說明偶聯(lián)物已經(jīng)偶聯(lián)成功。

圖4 OFL、OVA和OFL-OVA紫外光譜法掃描曲線

2.2 多克隆抗體性能檢測(cè)

用ELISA方法檢測(cè)1、2號(hào)兔多克隆抗體后,發(fā)現(xiàn)同源包被條件下,抗體不能識(shí)別NFLX,異源包被條件下,抗體對(duì)NFLX識(shí)別能力較強(qiáng),因此選用異源包被對(duì)1、2號(hào)兔多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)篩選。如圖5～6所示,1號(hào)兔抗體對(duì)NFLX標(biāo)準(zhǔn)品抑制率最高可達(dá)到88%,2號(hào)兔抗體對(duì)NFLX標(biāo)準(zhǔn)品抑制率最高可達(dá)到80%。

圖5 異源包被條件下1號(hào)兔抗體對(duì)NFLX的效價(jià)抑制曲線

2.3 適宜包被濃度及一抗稀釋倍數(shù)的確定

ELISA方法檢測(cè)中,一般選擇A450在1.0～1.5之間的包被原-抗體濃度組合,顯色值過高或過低都會(huì)影響最后的檢測(cè)結(jié)果[19]。因此,從方陣滴定濃度中選取A450在1.0～1.5之間,且具有較高抑制率的組合,即125、62.5、31.25、15.625 ng/mL 4個(gè)包被濃度,一抗稀釋倍數(shù)選定500倍,進(jìn)行進(jìn)一步篩選。抑制曲線結(jié)果如圖7所示,對(duì)應(yīng)的抑制曲線參數(shù)如圖8所示。

圖7 不同包被濃度對(duì)NFLX的抑制曲線

圖8 不同包被濃度對(duì)應(yīng)的抑制曲線參數(shù)

隨著包被原濃度的增高,Amax值呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),IC50先減小后增大,在125 ng/mL時(shí)達(dá)到最小值,Amax/IC50值則先增后降,在125 ng/mL時(shí)達(dá)到最大值。將Amax在1.0～1.5之間、Amax/IC50較高、IC50較低的包被濃度和一抗稀釋倍數(shù)作為最佳條件,最終選擇包被原濃度為125 ng/mL,一抗稀釋倍數(shù)為500作為最佳包被濃度及一抗稀釋倍數(shù)。

2.4 適宜二抗稀釋倍數(shù)的確定

如圖9～10所示,隨著二抗稀釋倍數(shù)的增高,競(jìng)爭(zhēng)曲線Amax值隨之降低,IC50值反而增高,Amax/IC50值降低,可能是由于二抗?jié)舛冉档蛯?dǎo)致二抗與一抗結(jié)合性變差。將Amax在1.0～1.5之間、Amax/IC50較高、IC50較低的二抗稀釋倍數(shù)作為最佳條件,選擇二抗稀釋倍數(shù)5 000倍作為最佳二抗稀釋倍數(shù)條件。

圖9 不同二抗稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)曲線

2.5 二抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間的確定

如圖11～12所示,隨著反應(yīng)時(shí)間減少Amax值也隨之降低,IC50值也降低,其中反應(yīng)時(shí)間分別為20和30 min的競(jìng)爭(zhēng)曲線Amax/IC50值相近。將Amax在1.0～1.5之間,Amax/IC50較高、IC50較低的二抗競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間作為最佳條件,確定二抗反應(yīng)時(shí)間為30 min。

圖11 不同二抗反應(yīng)時(shí)間對(duì)應(yīng)抑制曲線參數(shù)對(duì)比

2.6 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

選用上述最優(yōu)反應(yīng)條件,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖13所示。對(duì)NFLX半抑制濃度(IC50)為4.23 ng/mL,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.096,定量檢測(cè)線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.29～61.83 ng/mL,檢測(cè)限(IC10)為0.06 ng/mL。

2.7 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如表1所示,用該抗體建立的ELISA方法對(duì)諾氟沙星及其他4種常見氟喹諾酮類物質(zhì)交叉反應(yīng)率大于5%。方法可用于該5種氟喹諾酮類藥物的廣譜性檢測(cè)。

表1 抗體與9種氟喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)

2.8 添加回收試驗(yàn)

由表2可知,本方法對(duì)魚肉的添加回收率在77.90%～91.50%之間,平均添加回收率為83.94%;對(duì)蜂蜜的添加回收率在71.91%～87.29%之間,平均添加回收率為80.63%。兩種樣品的平均添加回收率均高于80%,添加回收率范圍均在70%～95%之間。證明了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度,可以用于實(shí)際樣品中諾氟沙星殘留的檢測(cè)。

表2 魚肉和蜂蜜樣品中諾氟沙星的添加回收率

3 結(jié)論與討論

諾氟沙星是半抗原,不具有免疫原性,需要與載體蛋白偶聯(lián),制備成合適的人工抗原,才能具有免疫原性。本文使用活潑酯法將諾氟沙星與BSA和OVA載體蛋白偶聯(lián),將氧氟沙星與OVA載體蛋白偶聯(lián)。在紫外光譜的鑒定下,偶聯(lián)物的吸收峰都發(fā)生了變化,說明偶聯(lián)成功。

用ELISA方法檢測(cè)經(jīng)諾氟沙星-BSA免疫的1～2號(hào)兔抗體,最終選擇靈敏度更高的異源包被(氧氟沙星-OVA)及1號(hào)兔進(jìn)行諾氟沙星檢測(cè)方法的建立。異源包被更靈敏的原因可能是因?yàn)橹Z氟沙星沒有N、O雜環(huán),而是一段碳鏈,沒有O平衡電荷,因而其制備出的抗體更能結(jié)合該位點(diǎn)不具備O平衡電荷能力的結(jié)構(gòu)。而氧氟沙星的N、O雜環(huán)可以有效地平衡分子電荷,使得結(jié)合部位環(huán)外氧受到的電荷影響較小,O的電荷密度較高,相對(duì)不易與抗體結(jié)合,在與諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品的競(jìng)爭(zhēng)中不占優(yōu)勢(shì)。所以異源包被時(shí),針對(duì)諾氟沙星的競(jìng)爭(zhēng)抑制率較高,效果更好。

包被原濃度的優(yōu)化中,Amax值呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),IC50值先減小后增大,在125 ng/mL時(shí)達(dá)到最小值,Amax/IC50值則先增后降,在125 ng/mL時(shí)達(dá)到最大值。推測(cè)當(dāng)包被原濃度較大時(shí),藥物與抗體結(jié)合量小于包被抗原與抗體結(jié)合量,表現(xiàn)出藥物對(duì)抗體競(jìng)爭(zhēng)力降低,導(dǎo)致較高的IC50;如果包被原濃度過低,反應(yīng)時(shí)抗體過量,藥物濃度變化對(duì)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)靈敏度降低。因此,只有包被抗原濃度適當(dāng)時(shí),藥物和包被原的競(jìng)爭(zhēng)力表現(xiàn)的最明顯,抗體靈敏度最高?；贓LISA反應(yīng)的條件優(yōu)化,最終建立NFLX的ic-ELISA檢測(cè)方法,其檢測(cè)靈敏度(IC50)為4.23 ng/mL,檢測(cè)限為0.06 ng/mL,是一種極為靈敏的諾氟沙星ELISA檢測(cè)方法。

在交叉實(shí)驗(yàn)中,諾氟沙星及其他4種常見氟喹諾酮類物質(zhì)交叉反應(yīng)率大于5%,具有較強(qiáng)廣譜性,可用于氟喹諾酮類藥物的廣譜檢測(cè)。雖然環(huán)丙沙星連接N、O雜環(huán)的三元環(huán)沒有碳鏈,但是其結(jié)構(gòu)容易吸引正電荷,使結(jié)合部位環(huán)外氧電荷密度較低,相對(duì)較易與抗體結(jié)合,因此其交叉反應(yīng)率較高。馬波沙星、吡哌酸、蘆氟沙星、莫西沙星分別是由于N、O雜環(huán)、含N六元環(huán)、強(qiáng)電負(fù)性S、兩個(gè)含N雜環(huán)的平衡電荷能力使其不易于諾氟沙星的抗體結(jié)合,因此無交叉反應(yīng)或交叉反應(yīng)率較低。而恩諾沙星和普盧利沙星的交叉反應(yīng)率比前幾種結(jié)構(gòu)較高的原因可能是三元環(huán)、結(jié)合部位附近的N、S雜環(huán)和含O雜環(huán)降低了結(jié)合部位的環(huán)外氧電荷密度,從而提高了交叉反應(yīng)率。

在實(shí)際樣品的檢測(cè)中,魚肉和蜂蜜中添加平均回收率均在80%以上,添加回收率范圍在70%～95%之間,回收率較好,方法穩(wěn)定,能夠滿足日常檢測(cè)要求,可用于諾氟沙星等物質(zhì)的廣譜快速檢測(cè)。