王秀云

(福建省藥品審核查驗中心,福州 350000)

糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類具有甾體母核結(jié)構(gòu)的類固醇類激素[1],具有強大而非特異性的抗炎、抑制免疫應答、抗休克、抗病毒、調(diào)節(jié)糖和脂肪代謝等藥理作用[2]。糖皮質(zhì)激素由于能顯著提高飼料的轉(zhuǎn)化率,起到促進生長的作用而被廣泛添加,有的生產(chǎn)者為了追求經(jīng)濟效益可能會過量或非法添加[3],而過量的糖皮質(zhì)激素會殘留在動物體內(nèi),進而通過食物鏈威脅消費者的健康安全。研究表明,過量食用糖皮質(zhì)激素會導致肥胖、骨質(zhì)疏松、內(nèi)分泌紊亂、消化系統(tǒng)異常等疾病[4]。

現(xiàn)有的國家標準與文獻報道中檢測糖皮質(zhì)激素常用的前處理方法有固相萃取[5-7]、液液萃取[8]和QuEChERS等[9-11]。QuECh ERS 因快速、簡便、安全、成本低等特點,被廣泛應用于農(nóng)獸藥殘留量的檢測中。QuEChERS吸附劑的主要成分有N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)、無水硫酸鎂和中性氧化鋁等[12],可有效去除動物源性食品基質(zhì)中的脂肪酸、糖類、酚類和一些大分子化合物,但是對磷脂的去除效果較差。而一些食品,如牛奶等中的磷脂會很大程度地影響目標化合物的離子化效果,進而影響方法的靈敏度和準確度。

鈦離子或鈦氧化物與具有磷酸基團或者含磷酸根的物質(zhì)具有強的配位作用,常用于富集該類化合物[13-15]。鑒于此,本工作在傳統(tǒng)Qu ECh ERS 吸附劑中加入二氧化鈦納米粒子,用于去除樣品中的磷脂,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLCMS/MS),同時測定了牛奶中15種糖皮質(zhì)激素的含量。該方法可有效去除樣品中的磷脂,降低基質(zhì)干擾,提高方法的靈敏度和準確度,能夠滿足日常檢測的需求,也可為其他磷脂含量高的動物源性食品中的獸藥殘留分析提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1290型超高效液相色譜儀;API 5500 型四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;CR21N 型高速冷凍離心機;MS3型渦旋混合器;Milli-Q 型超純水器。

單標準儲備溶液:1.0 g·L－1,取各糖皮質(zhì)激素標準品10 mg(精確到0.1 mg),用乙腈溶解并稀釋至10 mL,于－20 ℃保存。

混合標準中間溶液:10 mg·L－1,各取1 mL上述單標準儲備溶液于100 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,于－20 ℃保存。

曲安西龍標準品的純度為99.64%;氫化可的松標準品的純度為99.2%;潑尼松龍、乙酸氫化可的松標準品的純度為99.5%;潑尼松標準品的純度為99.6%;可的松標準品的純度為97.2%;甲基潑尼松龍、布地奈德標準品的純度為98.9%;倍他米松標準品的純度為99.3%;氟米松、地塞米松、倍氯米松標準品的純度為99.8%;曲安奈德標準品的純度為98.8%;氟米龍標準品的純度為97.90%;氯倍他索丙酸酯標準品的純度為98.5%。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸和乙酸均為色譜純;二氧化鈦粉末粒徑為200～400 nm;氯化鈉為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱 溫30 ℃;流 量0.25 mL·min－1;進樣量5.0μL;流動相A 為0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～2.0 min時,A 為70%;2.0～6.5 min時,A 由70%降至10%,保 持1.5 min;8.0～8.1 min 時,A 由10%跳轉(zhuǎn)至70%,保持1.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子(ESI＋)模式;噴霧電壓5 500 V;離子源溫度550 ℃;碰撞室入口電壓10 V,碰撞室出口電壓15 V;霧化氣壓力379.4 kPa,氣簾氣壓力206.9 kPa,輔助氣壓力379.4 kPa;多反應監(jiān)測(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子。

表1 15種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of 15 glucocorticoids

1.3 試驗方法

將牛奶樣品搖勻,分取5.0 g(精確至0.01 g)置于50 mL 離心管中,加入10 mL 乙腈,渦旋提取2 min,加入1.0 g氯化鈉進行鹽析。取5 mL上清液,加入吸附劑(500 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C18及50 mg二氧化鈦),高速渦旋1 min,以9 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min,取1 mL上清液,經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后進樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

對流動相中常用有機相乙腈、甲醇,常用水相水、0.1%甲酸溶液、0.5%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液對目標化合物的分離效果進行比較。結(jié)果顯示:相較于甲醇,用乙腈作為有機相時,多數(shù)目標化合物的峰形、響應和分離度更好;相較于水,用含有甲酸的水溶液作為水相時,目標化合物響應值更高,但是更高體積分數(shù)的甲酸溶液并沒有進一步優(yōu)化目標化合物的響應和峰形。因此,試驗選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作流動相,所得色譜圖見圖1。

圖1 15種糖皮質(zhì)激素的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of the 15 glucocorticoids

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

糖皮質(zhì)激素在質(zhì)譜中行為較為復雜,為確定最優(yōu)質(zhì)譜條件,本工作分別在正、負離子模式下考察目標化合物的響應情況,發(fā)現(xiàn)正離子模式下的響應和穩(wěn)定性均較好。因此,試驗選擇采用正離子掃描模式。采用蠕動泵直接進樣,將100μg·L－1混合標準溶液注入電噴霧離子源中,進行一級質(zhì)譜全掃描,結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)和相對分子質(zhì)量,確定各個目標化合物的準分子離子峰,并優(yōu)化去簇電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度等質(zhì)譜參數(shù);開啟碰撞氣,優(yōu)化碰撞能量和碰撞室出口及入口電壓,獲得的最佳質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 提取溶劑的選擇

糖皮質(zhì)激素的極性較弱,在有機溶劑中的溶解度較好,根據(jù)其性質(zhì),本工作選擇甲醇、乙腈、乙酸乙酯進行提取效率比較試驗。結(jié)果表明:甲醇提取液中共提取物較多,且與牛奶中水相難以分層,基質(zhì)效應明顯;乙腈能夠有效沉淀牛奶中的蛋白質(zhì),提取液比較澄清,且響應值較甲醇提取液的高;乙酸乙酯極性較小,提取效率比較低,需要多次富集濃縮,操作過程復雜。綜合考慮,試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.4 常用凈化吸附劑的選擇

在樣品凈化過程中,常被用作Qu ECh ERS 吸附劑的有無水硫酸鎂、PSA、中性氧化鋁、石墨化碳黑(GCB)、C18等。PSA 屬于堿性填料,具有弱陰離子交換作用,能夠有效去除脂肪酸、糖類、酚類等極性物質(zhì);GCB 對色素和甾醇類物質(zhì)有極強吸附作用,主要用于去除植物提取液中的色素成分,但GCB對帶有苯環(huán)的化合物具有一定吸附作用,不利于牛奶中目標化合物的提取;中性氧化鋁對脂肪具有較好的吸附效果;具有長烷基鏈的C18能夠吸附脂類、糖類等親脂性雜質(zhì)和一些大分子物質(zhì)。由于牛奶樣品的主要成分為水、脂肪、磷脂、蛋白質(zhì)、乳糖、無機鹽等,為了獲得較好的吸附效果,本試驗選擇以無水硫酸鎂、PSA、C18作吸附劑。為優(yōu)化各吸附劑的最佳用量,設(shè)計了三因素三水平正交試驗,見表2。

表2 正交試驗的各因素和水平Tab.2 Each factor and level of orthogonal experiment

根據(jù)正交試驗結(jié)果,不同吸附劑對各目標化合物的影響程度不盡相同:對于地塞米松、曲安西龍、氟米龍、氟米松、倍他米松、乙酸氫化可的松,各吸附劑的影響程度為C18＞PSA＞無水硫酸鎂,3種吸附劑的最佳組合為無水硫酸鎂500 mg＋PSA 50 mg＋C18100 mg;對于甲基潑尼松龍、可的松、潑尼松、潑尼松龍、氫化可的松,各吸附劑的影響程度為無水硫酸鎂＞C18＞PSA,3種吸附劑最佳組合為無水硫酸鎂1 000 mg＋PSA 50 mg＋C18100 mg;對于倍氯米松,各吸附劑的影響程度為PSA＞無水硫酸鎂＞C18,3種吸附劑的最佳組合為無水硫酸鎂500 mg＋PSA 50 mg＋C1850 mg;對曲安奈德,各吸附劑的影響程度為PSA＞無水硫酸鈉鎂＞C18,3種吸附劑的最佳組合為無水硫酸鎂500 mg＋PSA 50 mg＋C18100 mg;對于氯倍他索丙酸酯,各吸附劑的影響程度為PSA＞C18＞無水硫酸鎂,3種吸附劑的最佳組合為無水硫酸鎂1 000 mg＋PSA 50 mg＋C1850 mg;對布地奈德,各吸附劑的影響程度為C18＞PSA＞無水硫酸鎂,3種吸附劑的最佳組合為無水硫酸鎂500 mg＋PSA 50 mg＋C1850 mg。綜合考慮吸附劑對各個目標物的影響程度和凈化效果,確定的最優(yōu)組合為無水硫酸鎂500 mg＋PSA 50 mg＋C1850 mg。

2.5 二氧化鈦吸附劑用量的選擇

為驗證二氧化鈦對樣品中磷脂的去除效果,本工作取兩組陰性牛奶樣品(記為A 組和B組),分別加入1μg·kg－1糖皮質(zhì)激素進行加標回收試驗。比較了二氧化鈦加入前(A 組)、后(B 組)15種糖皮質(zhì)激素回收率的變化。結(jié)果表明,加入二氧化鈦后,15種糖皮質(zhì)激素的回收率有顯著提升,由A 組的61.1%～79.1%提升到B組的85.6%～95.1%,說明添加二氧化鈦可有效提高方法的準確度。

以加標陰性牛奶樣品為待測對象(加標量為1μg·kg－1),進一步考察了二氧化鈦用量(10,20,50,75,100,150 mg)對目標化合物回收率的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 二氧化鈦用量對15種糖皮質(zhì)激素回收率的影響Fig.2 Effect of TiO2 amount on the recovery of the 15 glucocorticoids

由圖2可知,隨著二氧化鈦用量的增加,目標化合物的回收率明顯增加,當二氧化鈦用量不小于20 mg時,目標化合物的回收率變化不大,說明牛奶樣品中的磷脂已去除完全?？紤]到動物源性樣品中磷脂含量的差異性,試驗選擇二氧化鈦吸附劑的用量為50 mg。

2.6 基質(zhì)效應

參考文獻[16],以相對響應值法進行基質(zhì)效應的考察,即先按照儀器工作條件分析分別用溶劑乙腈及陰性樣品溶液配制的混合標準溶液(基質(zhì)匹配混合標準溶液),然后以基質(zhì)匹配混合標準溶液、混合標準溶液中各目標化合物峰面積的比值與1的差值計算基質(zhì)效應值。結(jié)果顯示,目標化合物的基質(zhì)效應值為－25.2%～－28.7%,說明存在基質(zhì)抑制效應?？紤]到試驗成本及可操作性,本工作選擇用基質(zhì)匹配法消除基質(zhì)效應。

2.7 標準曲線和檢出限

用陰性樣品溶液配制質(zhì)量濃度為0.5,1.0,2.0,5.0,10,20,50μg·L－1的混合標準溶液系列并上機測定,以目標化合物定量離子的峰面積為縱坐標,質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性擬合。結(jié)果顯示:各目標化合物標準曲線的線性范圍均為0.5～50μg·L－1,相關(guān)系數(shù)和線性回歸方程見表3。

以不小于3倍信噪比的信號對應的質(zhì)量濃度計算檢出限,所得結(jié)果見表3。

由表3可知,15 種目標化合物標準曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0,檢出限為0.1～0.3μg·kg－1。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.3 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.8 精密度和回收試驗

對陰性牛奶樣品進行1,2,10倍檢出限的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表4。

由表4 可知,15 種目標化合物的回收率為89.7%～104%,測定值的RSD 為3.2%～12%。方法具有良好的回收率和較高的精密度,符合實際檢測要求。

表4 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n=6)

表4(續(xù))

2.9 樣品分析

應用本方法對10批市售的牛奶樣品進行分析,僅在1批牛奶樣品中檢出了微量氫化可的松,檢出量為0.37μg·kg－1,而其他9批樣品均未檢出糖皮質(zhì)激素。

本工作根據(jù)牛奶樣品中磷脂含量高的特點,結(jié)合已有文獻,在傳統(tǒng)的QuEChERS 吸附劑中加入二氧化鈦吸附劑來消除牛奶樣品中的磷脂,并通過正交試驗確定了各傳統(tǒng)QuECh ERS吸附劑的種類及用量,通過對比試驗確定二氧化鈦的用量,為消除復雜基體的干擾,以基質(zhì)匹配法進行定量,實現(xiàn)了牛奶中15種糖皮質(zhì)激素的同時測定。本方法具有操作簡便、靈敏度高、準確可靠等優(yōu)點,有一定的應用推廣價值。