郭子嫻，蔣 妍，全紅花，李 明

(揚州大學 環(huán)境科學與工程學院,揚州 225127)

微藻是一種廣泛分布于海洋、淡水中的單細胞生物[1],其中富含的油脂是重要的生物質燃料[2],不同種類微藻中油脂的組成及含量相差較大[3-6]。目前,相關測定方法有衍生化-氣相色譜法、近紅外光譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法。衍生化-氣相色譜法對熱敏感物質影響較大[7],近紅外光譜法操作較難以及所需樣品量較大[8],毛細管電泳法的表面電滲變化對分離重現(xiàn)性影響較大[9],而附熒光檢測器的高效液相色譜法(FLD-HPLC)的分離度及靈敏度較高,適用于不同脂肪酸衍生物的分析[10-11]。脂肪酸由于不具有熒光特性,需要通過熒光衍生試劑與脂肪酸反應生成熒光衍生物來實現(xiàn)檢測[12]。常見的熒光衍生試劑有溴甲基類、哌嗪類、重氮甲烷類、氨基類化合物等[13-14]。丹磺酰氯(DNS-CL)是常用的氨基化合物熒光衍生試劑的原料,具有靈敏度高的優(yōu)點[15-17]。但DNS-CL 不能直接用于脂肪酸的衍生化。

鑒于此,本工作制備了二甲基氨基哌嗪功能化的DNS-CL 熒光衍生試劑(DNS-Pi-NH2),并用其衍生化小球藻中碳原子為10～20 的脂肪酸,用FLD-HPLC測定脂肪酸衍生物的含量,以期為微藻中碳原子數(shù)為10～20的脂肪酸含量的準確測定提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

L-2000型高效液相色譜儀;Bojin C18固相萃取柱(2 000 mg/12 mL);RE52CS型旋轉蒸發(fā)儀;Cary 610/670型顯微紅外光譜儀;AVANCE 600型核磁共振波譜儀;ma Xis型超高分辨飛行時間質譜儀,配電噴霧離子(ESI)源。

單標準儲備溶液:2.5×10－4mol·L－1,取適量各脂肪酸標準品,用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解并定容至10.0 mL容量瓶中,搖勻備用。

混合標準溶液系列:取適量脂肪酸單標準儲備溶液,用DMF 逐級稀釋,配制成2.0×10－10,2.0×10－9,2.0×10－8,2.0×10－7,2.0×10－6,2.0×10－5,2.0×10－4mol·L－1混合標準溶液系列。

十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸和二十烷酸標準品的純度均大于98%;順-9-十八(碳)烯酸、順-9,12-十八(碳)烯酸、順-7,10,13-十六(碳)烯酸標準品的純度均大于85%;硬脂酸甲酯標準品的純度大于97%;DMF的純度大于99.5%;DNS-CL、N-(2-氨乙基)哌嗪的純度均大于99%;三苯基膦(TPP)的純度大于95%;二丙基二硫醚(DPDS)的純度大于98.0%;試驗用水為去離子水。

小球藻(微藻的一種)脂肪酸甲酯樣品由韓國浦項科技大學微流控應用化學中心提供。

1.2 儀器工作條件

Eclipse XDB C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相為90%(體積分數(shù),下同)乙腈溶液;等度洗脫,時間30 min;流量0.8 mL·min－1;進樣量10μL;熒光激發(fā)(λex)和發(fā)射波長(λem)分別為360,520 nm。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNS-Pi-NH2的合成

取DNS-CL 100 mg,在避光條件下溶于5 mL丙酮中,得到A 液。取碳酸鈉30 mg和N-(2-氨乙基)哌嗪300 mg,溶于3 mL水中,然后與10 mL乙腈混合,得到B液。將A 液緩緩滴入B 液中,避光攪拌30 min,得到C液。加入和C液等體積的乙酸乙酯進行萃取,搖勻后靜置分層。收集上層(乙酸乙酯層)液體,于78 ℃旋轉蒸發(fā)至溶液體積不大于1 mL。將得到的液體過C18固相萃取柱。洗脫液用紅外光譜、核磁共振碳譜(13C NMR)以及ESI-超高分辨飛行時間質譜(ESI-MS,質量數(shù)362.286 6)表征,所得物質即為DNS-Pi-NH2。

1.3.2 脂肪酸標準溶液的衍生化

取上述DNS-Pi-NH2和0.039 66 g TPP,分別用1.0 mL乙腈溶解制得DNS-Pi-NH2、TPP 溶液。取脂肪酸混合標準溶液、DNS-Pi-NH2溶液、DPDS和TPP溶液各175,10,25,25μL于1.5 mL塑料離心管中,室溫振蕩10 min,使衍生反應充分進行。待反應完成后,將產(chǎn)物轉移至10 mL 容量瓶中,用90%乙腈溶液稀釋至刻度,供FLD-HPLC分析。

1.3.3 樣品的測定

將含0.5 mol·L－1氫氧化鉀的乙醇溶液5 mL置于水浴燒杯中,加入2.0 mg小球藻脂肪酸甲酯樣品。連接回流冷凝管,于79 ℃加熱60 min,直至燒杯內(nèi)溶液澄清透明,無明顯油珠,此時小球藻脂肪酸甲酯已被完全皂化。取下水浴燒杯,加入2～3滴酚酞指示劑,滴加0.5 mol·L－1鹽酸溶液至紅色消失。繼續(xù)于79 ℃水浴加熱30 min,使乙醇完全蒸發(fā)。所得固體用10 mL 水清洗,以轉速8 000 r·min－1離心5 min。再加入適量水于離心管中,振蕩5 min,產(chǎn)物用0.45μm 尼龍注射器過濾,以去除氯化鉀等雜質,烘干后,即得小球藻脂肪酸樣品。取1 mg小球藻脂肪酸樣品,按照1.3.2節(jié)試驗方法衍生和測定。

2 結果與討論

2.1 DNS-Pi-NH2 表征結果的分析

2.1.1 紅外光譜

所得紅外光譜圖見圖1。

圖1 紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum

參考文獻[18],分析圖1中官能團的紅外特征峰:3 363.4 cm－1處為N－H 的伸縮振動吸收峰,2 914.1,2 828.0 cm－1處為C－H 的伸縮振動吸收峰,1 455.3 cm－1處為CH2的變形振動吸收峰;1 665.3 cm－1處為芳環(huán)中C＝C 骨架伸縮振動吸收峰,說明合成的物質為芳香族化合物;1 572.8 cm－1處為N－H 的變形振動吸收峰,1 455.3 cm－1處為芳環(huán)C＝C 伸縮振動和CH3的C－H 不對稱變形振動的重合吸收峰,1 323.2 cm－1處為C－N(芳基碳)的伸縮振動吸收峰,1 143.5,1 067.5 cm－1處為C－N(烷基碳)的伸縮振動吸收峰,945.8 cm－1處為N(CH3)2的彎曲振動吸收峰。根據(jù)以上推斷,得出合成物質中含有苯環(huán)、N－H、C－N(芳基碳)、C－N(烷基碳)、CH2、CH3、N(CH3)2等官能團。

2.1.213C NMR

合成目標物的13C NMR 圖見圖2。

圖2 合成目標物和DNS-CL的13 C NMR 圖Fig.2 13 C NMR images of synthetic target and DNS-CL

結果表明:大于110×10－6的峰歸屬于DNSCL芳環(huán)中的碳;30×10－6～70×10－6的4個主峰歸屬于2-乙基氨基哌嗪中的碳;77×10－6處峰歸屬于溶劑氘代三氯甲烷中的碳。綜上可說明DNS-Pi-NH2已成功制備,推測其結構見圖3。

圖3 DNS-Pi-NH2 的結構Fig.3 Structure of DNS-Pi-NH2

2.1.3 ESI-MS

為了明確合成目標物(化學式M)的結構,對該物質進行ESI-MS分析,所得準分子離子[M＋H]＋的質量數(shù)為363.185 4,和DNS-Pi-NH2的理論值一致,說明DNS-Pi-NH2已正確合成。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱

以1.0×10－6mol·L－1的十二烷酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸混合標準溶液為待測對象,考察了Eclipse XDB C8色譜柱和Hypersil ODS C18色譜柱對4種典型脂肪酸衍生物的分離效果的影響。結果顯示:以Hypersil ODS C18色譜柱分離時,十八烷酸和二十烷酸不能實現(xiàn)基線分離;Eclipse XDB C8色譜柱可實現(xiàn)4種目標物基線分離,且峰形較好。因此,試驗選擇以Eclipse XDB C8色譜柱分離各脂肪酸衍生物。

2.2.2 流動相乙腈溶液體積分數(shù)

試驗進一步考察了流動相乙腈溶液的體積分數(shù)分別為50%,90%時對以上4種脂肪酸衍生物分離效果的影響,結果見圖4。

圖4 不同體積分數(shù)乙腈溶液下4種脂肪酸衍生物的色譜圖Fig.4 Chromatograms of four fatty acid derivatives under different volume fractions of acetonitrile solution

由圖4可知:當乙腈溶液體積分數(shù)為50%時,可在色譜圖中明顯觀察到4 種脂肪酸衍生物,但4種脂肪酸衍生物色譜峰重疊嚴重,分離度差,未能得到基線分離;當乙腈溶液體積分數(shù)為90%時,30 min內(nèi)可實現(xiàn)4 種脂肪酸衍生物的基線分離。因此,試驗選擇的流動相為90%乙腈溶液。

在上述優(yōu)化試驗條件下,1.0×10－6mol·L－1混合標準溶液的色譜圖見圖5。

由圖5可知,8種脂肪酸衍生物可在30 min內(nèi)完成分離。

圖5 混合標準溶液的色譜圖Fig.5 Chromatogram of the mixed standard solution

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線和檢出限

按照1.3.2 節(jié)試驗方法分析混合標準溶液系列,以各脂肪酸的濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,各脂肪酸標準曲線的線性范圍均為2.0×10－10～2.0×10－4mol·L－1,線性回歸方程、相關系數(shù)見表1。

按照1.3.2節(jié)試驗方法對1.0×10－10mol·L－1脂肪酸混合標準溶液重復分析11次,計算峰面積的標準偏差(s),以3s與標準曲線斜率(k)的比值計算檢出限(3s/k),所得結果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.3.2 精密度和回收試驗

用微藻培養(yǎng)液進行精密度和準確度試驗。向該微藻培養(yǎng)液中添加適量混合標準溶液,使加標量達到2.0×10－6mol·L－1,再重復測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結果顯示,各脂肪酸的回收率為95.3%～102%,測定值的RSD為1.7%～2.6%。

2.4 樣品分析

按照試驗方法分析小球藻脂肪酸甲酯樣品,色譜圖見圖6。

由圖6可知,小球藻樣品中含有的脂肪酸依次為十六烷酸、順-9,12-十八(碳)烯酸、順-7,10,13-十六(碳)烯酸、順-9-十八(碳)烯酸,與文獻結果一致[19],4種脂肪酸檢出量分別為3.08,0.64,0.83,2.57 mg·g－1。

圖6 實際樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of the actual sample

本工作以自制DNS-Pi-NH2衍生化碳原子為10～20的脂肪酸,用FLD-HPLC 檢測。本方法衍生溫度低、反應時間短、樣品用量少、精密度和準確度較好,可為微藻中脂肪酸含量的測定提供一種簡便、快速、有效的分析方法。