章從恩，陳 熹，張學(xué)強(qiáng),2，于小紅，李 萌，崔宇濤,3，馬雨晴，馬致潔#

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科，北京 100050； 2.寧波市第一醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 寧波 315010； 3.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原 030006)

抗生素相關(guān)腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD)是抗菌藥物治療中常見的藥品不良事件，發(fā)生率為5%～39%，是一個(gè)全球性的公共健康問題。流行病學(xué)研究結(jié)果表明，AAD的高發(fā)病率與近年來抗菌藥物的廣泛使用密切相關(guān)，幾乎所有的抗菌藥物，特別是對(duì)厭氧菌有抗菌活性的藥物，如氨基青霉素類、頭孢菌素類和克林霉素，都與AAD的發(fā)病有關(guān)[1-3]。AAD的臨床表現(xiàn)從輕度、自限性腹瀉到嚴(yán)重腹瀉并伴有艱難梭菌感染(約占25%)或假膜性結(jié)腸炎，甚至死亡[4]。AAD目前尚無特效治療方法，其治療主要包括停用或更換誘發(fā)AAD的抗菌藥物[5]。此外，基于隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的Meta分析結(jié)果顯示，益生菌可使AAD的發(fā)病率降低38%[6]；但部分研究表明其證據(jù)不足，特別是對(duì)艱難梭菌相關(guān)腹瀉的影響[7]。因此，開發(fā)治療AAD的新藥和治療方案非常重要。

目前，中醫(yī)對(duì)AAD尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，主流觀點(diǎn)根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將AAD歸入“泄瀉”范疇[8]。使用抗菌藥物易損傷脾胃之陽，脾胃虧虛，脾陽虛則不能運(yùn)化水濕，清氣不升，濁氣不降，清濁相混而成泄瀉。理中湯出自《傷寒論》，原方為“理中丸”，后世醫(yī)家多以湯劑用之，其中成藥也有“理中丸”供臨床選用。理中湯由人參、白術(shù)、炙甘草及干姜4味藥物組成，為常用溫中方劑，具有溫中祛寒、補(bǔ)氣健脾的功效，用于治療脾胃虛寒，自利不渴，嘔吐腹痛腹瀉等[9]。理中湯及其加減方被廣泛用于腹瀉的治療[10-11]。另外，課題組前期研究結(jié)果顯示，干姜可以顯著改善AAD腸道菌群并改善AAD[12]。分析認(rèn)為理中湯對(duì)AAD可能有一定療效。同時(shí)，已有臨床研究結(jié)果顯示，理中湯對(duì)抗生素相關(guān)性假膜性結(jié)腸炎有治療作用[13]。本研究進(jìn)一步基于大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討理中湯對(duì)AAD的治療效果及其干預(yù)AAD過程中對(duì)腸道菌群的作用，為臨床使用理中湯治療AAD提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠50只，約5周齡，平均體重(165±15) g，雌雄各半，購自維通利華公司，許可證號(hào)為SCXK(京)-2017-0033。動(dòng)物飼養(yǎng)于維通利華公司，溫度保持在(20±2) ℃，濕度為60%～70%，每日黑暗/光照12 h循環(huán)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行(倫理批號(hào)：21-2004)。

1.2 儀器

ABI GeneAmp? 9700型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國Applied Biosystems公司)；PL-203型電子分析天平(美國Mettler-Toledo公司)；DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；Illumina MiSeq平臺(tái)(美國Illumina公司)。

1.3 藥品與試劑

人參(批號(hào)為1906005，產(chǎn)地吉林，購自北京同春堂藥業(yè)有限公司)，白術(shù)(批號(hào)為H0091，產(chǎn)地安徽，購自北京均大制藥有限公司)，干姜(批號(hào)為200930003，產(chǎn)地四川，購自北京仟草中藥飲片有限公司),炙甘草(批號(hào)為200516，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，購自北京燕北飲片廠)；經(jīng)廠家檢驗(yàn)，上述藥材均符合《中華人民共和國藥典：一部》(2020年版)中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊(Bif，華潤醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)為22120210319)；鹽酸克林霉素(山東方明藥業(yè)，批號(hào)為181011)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物的制備

理中湯水煎液的制備參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]及《傷寒論》159條理中湯的記載，按照1∶ 1∶ 1∶ 1的比例取人參、白術(shù)(生)、干姜及甘草(炙)4種藥材，加6倍量水浸泡20 min，提取30 min，過濾；殘?jiān)?倍量水煎煮第2次，第2次煎煮20 min。合并兩次煎煮液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃下濃縮至1.0 g/mL(相當(dāng)于原藥材)，4 ℃存儲(chǔ)備用。雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊的制備參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]，灌胃前取雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊中內(nèi)容物，迅速溶于0.9%氯化鈉溶液中，立刻灌胃。

2.2 AAD大鼠模型的制作、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對(duì)照組(Con組)、AAD模型組(Mod組)、陽性對(duì)照組(Bif組)、理中湯低劑量治療組(LZDL組)及理中湯高劑量治療組(LZDH組)。造模期間，Con組大鼠每日灌胃0.9%氯化鈉溶液2 mL，Mod組及其他給藥治療組大鼠均灌胃抗菌藥物混合溶液(克林霉素50 mg/mL、氨芐西林55.5 mg/mL及鏈霉素27.75 mg/mL)2 mL，連續(xù)灌胃7 d完成AAD模型的制作[15-16]。

模型制作完成后，實(shí)驗(yàn)第8—14日，按照分組連續(xù)給藥7 d。Con組和Mod組大鼠每日給予0.9%氯化鈉溶液2 mL，Bif組大鼠每日給予Bif 70 mg/kg，LZDL組、LZDH組大鼠分別給予理中湯水煎液3.75、7.5 g/kg(按生藥量計(jì)算)[17]。實(shí)驗(yàn)第14日治療期結(jié)束，每組處死5只大鼠，取全結(jié)腸及結(jié)腸糞便，結(jié)腸制作為“Swiss roll”[18]，固定后做成石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，糞便用于菌群分析。實(shí)驗(yàn)第21日恢復(fù)期結(jié)束，處死剩余大鼠，取結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色分析。

2.3 大鼠一般狀況分析

實(shí)驗(yàn)過程中，每日觀察大鼠精神狀況、毛色、糞便狀況及尾部肛口干凈程度等。實(shí)驗(yàn)第4、7、10、14、17及21日，重點(diǎn)觀察小鼠糞便及體重的變化，測量大鼠的飲水量及攝食量。

2.4 腹瀉程度分析

2.4.1 120 min糞便重量：實(shí)驗(yàn)第4、7、10、14、17及21日上午9:00，將大鼠放入獨(dú)立代謝籠，上午11:00收集糞便，稱重。

2.4.2 糞便含水量：將各時(shí)間收集到的糞便放在鼓風(fēng)干燥箱中完全烘干(完全烘干指在95 ℃下烘0.5 h，糞便質(zhì)量的變化<1%)，再進(jìn)行稱重，計(jì)算糞便含水量。

2.4.3 腹瀉程度評(píng)分：褐色、成型干燥的硬糞便為1分；黃色或褐色、成形濕潤的軟糞便為2分；黃色或褐色、稀爛不成形的水狀糞便為3分。

2.5 結(jié)腸組織病理學(xué)檢測

取大鼠結(jié)腸，制作成“Swiss-roll”后，放入4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，石蠟包埋、切片，并進(jìn)行HE染色，觀察結(jié)腸炎癥、水腫等病理特征。

2.6 糞便的采集

解剖大鼠結(jié)腸，無菌采集結(jié)腸糞便(內(nèi)容物)，迅速放入液氮中淬滅30 min，隨后于-80 ℃保存，每組5份樣本。

2.7 微生物DNA提取和16S rRNA基因測序及數(shù)據(jù)分析

按照說明書的規(guī)定，采用OMEGA-soil DNA Kit提取腸道菌群DNA，采用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)及806R (5′-GGACTACVGGGTW TCTAAT-3′)引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)一步純化，利用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量。純化的擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程在Illumina MiSeq平臺(tái)上混合并配對(duì)測序。基于測序數(shù)據(jù)進(jìn)行擴(kuò)增子序列變異體(ASV)聚類和物種分類分析。基于數(shù)據(jù)均一化后的ASV物種豐度譜，再對(duì)ASV進(jìn)行豐度分析、多樣性分析等，并對(duì)各水平上物種群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。然后進(jìn)行物種組成的聚類分析和比較分析，研究各組樣品之間的物種組成差異。數(shù)據(jù)采用Majorbio云平臺(tái)(http://www.majorbio.com)進(jìn)行分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠腹瀉程度的變化

模型制作期間，實(shí)驗(yàn)第3日及第7日，除Con組外，Mod組及各給藥組大鼠均出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀。相對(duì)于Con組，其他各組大鼠120 min糞便重量、糞便含水量及糞便評(píng)分均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥期間，Bif組大鼠腹瀉程度有一定改善，120 min糞便重量及糞便評(píng)分較Mod組有一定的降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。理中湯治療組中，LZDL組及LZDH組大鼠腹瀉癥狀均顯著改善，120 min糞便重量、糞便含水量及糞便評(píng)分均顯著降低；治療期結(jié)束(實(shí)驗(yàn)第14日)，LZDL組及LZDH組大鼠的120 min糞便重量、糞便含水量及糞便評(píng)分均較Mod組顯著降低，其中LZDL組的降低效果略優(yōu)于LZDH組；治療恢復(fù)期，Bif組與Mod組大鼠腹瀉狀況的差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LZDL組及LZDH組大鼠120 min糞便重量、糞便含水量及糞便評(píng)分均進(jìn)一步降低，見圖1。

A.大鼠糞便評(píng)分；B.大鼠糞便評(píng)分變化曲線圖；C.大鼠糞便含水量變化曲線圖；D.大鼠120 min糞便重量變化曲線圖；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01A.fecal score of rats; B.curve of fecal score in rats; C.curve of fecal water content in rats; D.curve of 120 min fecal weight in rats; vs. the blank control group, *P<0.05, **P<0.01; vs. the model group, #P<0.05, ##P<0.01圖1 理中湯對(duì)AAD大鼠腹瀉癥狀的作用。Fig 1 Effects of Lizhong decoction on diarrhea symptoms in AAD rats

3.2 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)分析

大鼠結(jié)腸HE染色結(jié)果見圖2，其中包括治療期結(jié)束(第14日)及恢復(fù)期結(jié)束(第21日)的結(jié)腸組織病理學(xué)分析。由圖2可知，治療期及恢復(fù)期結(jié)束后，Con組大鼠結(jié)腸固有層可見少量炎癥細(xì)胞，其余未見顯著病理改變；而Mod組大鼠固有層可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，并有一定程度的水腫及上皮細(xì)胞脫落；Bif組大鼠在治療期及恢復(fù)期結(jié)束后，與Mod組相比，炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變有一定程度的改善；LZDL組及LZDH組大鼠在治療期及恢復(fù)期結(jié)束后，均可見上述病理改變顯著改善，尤其LZDL組病理結(jié)構(gòu)與Con組更為接近，其腸腺正常，黏膜層結(jié)構(gòu)完整。

圖2 大鼠結(jié)腸組織代表性視野圖(HE，×200，n=5)Fig 2 Typical histopathological section photographs of colon tissue in rats (HE, ×200, n=5)

3.3 理中湯對(duì)腸道菌群多樣性的影響

由上述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，理中湯對(duì)AAD大鼠有一定的治療作用。腸道菌群在AAD發(fā)病機(jī)制中有至關(guān)重要的作用。因此，本研究進(jìn)一步進(jìn)行腸道菌群分析，探討理中湯治療AAD可能的作用機(jī)制。前述結(jié)果顯示，理中湯低劑量(LZDL組)藥效略優(yōu)于高劑量(LZDH組)，因此，后續(xù)采用Con組、Mod組、Bif組和LZDL組四組進(jìn)行腸道菌群分析。

α多樣性主要用于研究均勻生境下的群落多樣性，其可通過一系列α多樣性指數(shù)進(jìn)行物種豐度及多樣性等的分析。本研究采用Sobs、ACE、Shannon及Coverage指數(shù)4項(xiàng)指標(biāo)，其中Sobs及ACE指數(shù)常用以刻畫群落豐度，Shannon指數(shù)常用以反映群落多樣性，Coverage指數(shù)可以反映測序的群落覆蓋度[19-20]。本研究中，Sobs及ACE指數(shù)顯示，Mod組大鼠腸道菌群豐度較Con組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；Bif組及理中湯治療組(LZDL組)大鼠腸道菌群豐度有一定程度的恢復(fù)，理中湯治療后期菌群豐度略優(yōu)于Bif組，見圖3(A—B)。Shannon指數(shù)顯示，Mod組大鼠腸道菌群多樣性較Con組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；Bif組及理中湯治療組(LZDL組)大鼠腸道菌群多樣性有一定程度的恢復(fù)，但兩組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3(C—D)?？梢?，Bif及理中湯對(duì)AAD大鼠腸道菌群豐度及多樣性均有一定程度的改善，兩者作用相當(dāng)。

A.Sobs指數(shù)；B.ACE指數(shù)；C.Shannon指數(shù)；D.Coverage指數(shù)；E.PCoA分析; F.NMDS分析；組間比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001A. Sobs index; B. ACE index; C. Shannon index; D. Coverage index; E. PCoA; F. NMDS; comparison between groups, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001圖3 理中湯對(duì)AAD大鼠腸道菌群α多樣性及β多樣性的影響Fig 3 Effects of Lizhong decoction on α-diversity and β-diversity of gut microbiota in rats

β多樣性分析是對(duì)不同樣品間微生物群落的構(gòu)成進(jìn)行比較。本研究通過主坐標(biāo)分析(PCoA)和非度量多維尺度分析(NMDS)2種分析方法對(duì)比各組大鼠的菌群構(gòu)成。PCoA分析及NMDS分析可研究樣本群落組成的相似性或差異性，不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同分組的樣本，兩樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本物種組成越相似[21]。本研究中，PCoA分析和NMDS分析結(jié)果顯示，Con組、Mod組與各治療組明顯分為不同類群，相對(duì)于Bif組及Mod組，LZDL組各樣本與Con組更為接近，見圖3(E—F)。表明理中湯治療后大鼠腸道菌群多樣性與正常組更為接近，而Bif的作用稍弱。

3.4 理中湯對(duì)菌群組成的影響分析

基于ASV的絕對(duì)豐度及注釋信息，在門水平上，根據(jù)群落Bar圖分別對(duì)占比最多的厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、變形菌門(Proteobacteria)及放線菌門(Actinobacteria)進(jìn)行分析，見圖4；并進(jìn)一步分析屬水平上腸道菌群的組成，見圖5。

A.大鼠腸道菌群屬水平群落組成bar圖；B.Con、Mod、Bif及LZDL四組大鼠腸道菌群屬水平各菌群類群相對(duì)豐度差異；C-E.各組大鼠腸道菌群屬水平各菌群類群相對(duì)豐度兩兩比較結(jié)果，擬桿菌屬(C)、克雷伯菌屬(D)及Parasutterella菌屬(E)多樣本Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)結(jié)果A. bar chart of rat gut microbiota at the phylum level; B. differences of relative abundance of gut microbiota in Con, Mod, Bif and LZDL groups; C-E. pairwise comparison of relative abundance of each group at the genus level of rats, and Kruskal-Wallis H test results of Bacteroides spp. (C), Klebsiella spp. (D) and Parasutterella spp. (E) 圖5 理中湯在屬水平上對(duì)大鼠腸道菌群的影響Fig 5 Effects of Lizhong decoction on gut microbiota in rats at phylum level

由圖4(A—C)可知，AAD模型制作完成后，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門及放線菌門菌群豐度具有顯著改變。由圖4(A)及圖5(B)可知，四組大鼠腸道菌群組成在門水平上有較明顯的分類趨勢。Con組厚壁菌門平均比例為(65.91±12.79)%；Mod組厚壁菌門平均比例為(28.02±12.57)%，與Con組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；LZDL組厚壁菌門平均比例為(55.03±5.27)%，較Mod組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Bif組與Mod組厚壁菌門平均比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4(C—D)。另外，Mod組與Con組大鼠擬桿菌門、變形菌門及放線菌門等菌群比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但Bif組與LZDL組大鼠擬桿菌門、變形菌門及放線菌門等菌群比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4(E)。

由圖5(A—B)可知，在屬水平上，Con組、Mod組、Bif組及LZDL組大鼠擬桿菌屬(Bacteroidesspp.)、乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)及埃希-志賀菌屬(Escherichia-Shigellaspp.)等腸道菌群有顯著差異。相對(duì)于Con組，Mod組中擬桿菌屬(P<0.001)、克雷伯菌屬(Klebsiellaspp.)(P<0.01)及Parasutterella屬(P<0.01)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相對(duì)于Mod組，LZDL組中擬桿菌屬有一定程度恢復(fù)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.05

4 討論

目前，越來越多的研究開始關(guān)注AAD的潛在機(jī)制和治療方法。研究結(jié)果顯示，AAD發(fā)病的機(jī)制主要為抗菌藥物的使用破壞了腸道正常菌群，導(dǎo)致腸道膽汁酸、短鏈脂肪酸等代謝紊亂，而后腸道屏障被破壞，影響水液吸收，最終導(dǎo)致腹瀉[22-23]。在上述各種病因中，腸道菌群的改變被認(rèn)為是AAD發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，因此，益生菌被廣泛用于治療不同類型的AAD。此外，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一些天然藥物及其加工產(chǎn)品可以通過恢復(fù)腸道菌群而改善AAD，如中華仙影海葵(Cereussinensis)多糖[24]、人參多糖[25]、山藥[26]和中成藥香連丸[27]等可加快腸道菌群的恢復(fù)，對(duì)緩解AAD有益。

理中湯為溫中祛寒、補(bǔ)氣健脾的代表方劑。本研究中發(fā)現(xiàn)，理中湯可以顯著改善AAD大鼠的腹瀉程度，可在一定程度上提高AAD大鼠腸道菌群的豐度和多樣性，其作用在短期內(nèi)優(yōu)于Bif。值得注意的是，Bif并未對(duì)AAD大鼠有顯著的治療作用，可能與Bif使用時(shí)間有關(guān)，Bif的療程一般為2周。臨床研究結(jié)果顯示，使用Bif 3個(gè)月可建立新的腸道穩(wěn)態(tài)[28]。

本研究中，AAD大鼠經(jīng)理中湯治療后，在門水平上，厚壁菌門菌群顯著恢復(fù)，而Bif干預(yù)后大鼠的厚壁菌門比例沒有明顯改變。在屬水平上，AAD大鼠中擬桿菌屬、克雷伯菌屬及Parasutterella屬菌群比例顯著升高，而理中湯低劑量可較為顯著地降低上述菌群的比例。擬桿菌為利害兼?zhèn)渚溆兄诜纸馐澄锊a(chǎn)生身體所需的營養(yǎng)和能量、維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)，但當(dāng)其易位至腸道以外的身體其他部位時(shí)，其會(huì)充當(dāng)致病菌，導(dǎo)致膿腫和其他感染[29]。理中湯治療AAD可能與擬桿菌屬菌群的改變有關(guān)。值得注意的是，本研究結(jié)果顯示，理中湯可顯著降低克雷伯菌屬菌群的比例?？死撞鷮購V泛被認(rèn)為是有害菌，其主要可導(dǎo)致肺部的感染，另外，研究結(jié)果表明克雷伯菌屬細(xì)菌如產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)可導(dǎo)致AAD[30-31]。本研究結(jié)果顯示，理中湯還可降低Parasutterella屬菌群比例。目前關(guān)于Parasutterella屬的研究較少，有研究結(jié)果表明，Parasutterella屬與炎癥性腸病及腸道炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[32]。其可能與AAD的發(fā)生發(fā)展存在正相關(guān)關(guān)系。綜上，推測理中湯可能通過降低擬桿菌屬、克雷伯菌屬及Parasutterella屬菌群而改善AAD大鼠的腹瀉程度。