馬 曉，尚 昆，林海珊，王 婧

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科，北京 100050)

胰腺癌是發(fā)病率高、致死率高的消化道惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、發(fā)展迅速和治療效果欠佳的特點。即使目前腫瘤的靶向治療及免疫治療發(fā)展迅速，厄洛替尼、奧拉帕利和程序性細胞死亡蛋白-1抑制劑相繼被納入指南，但患者的生存期并未出現(xiàn)顯著延長，治療尚無明顯突破。胰腺癌患者腹部脹滿不適常見，大黃類藥物有一定療效，既往研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)大黃素具有保護胰腺、抑制胰腺癌細胞增殖的作用[1]。雷替曲塞為抗代謝類葉酸類似物，能夠經(jīng)過還原葉酸載體攝入腫瘤細胞，進而被葉酰聚谷氨酸合成酶轉(zhuǎn)化成聚谷氨酸鹽，并貯存于腫瘤細胞中，從而發(fā)揮更強的抑制胸苷酸合成酶作用，并能夠延長抑制時間，有效提高抗瘤活性[2]。對于老年患者或者心臟風(fēng)險大的患者，接受雷替曲塞治療的安全性良好，因此，雷替曲塞在臨床中應(yīng)用廣泛。本研究擬通過大黃素與雷替曲塞聯(lián)合應(yīng)用，觀察其對胰腺癌細胞增殖能力的影響及對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的作用效果，為臨床用藥提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

PANC-1胰腺癌細胞系購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代。

1.2 儀器

ELx800型酶標儀(美國BioTek公司)；NovoCyte 1040型流式細胞儀[艾森生物(杭州)有限公司]；UV-2450紫外光度儀(日本Shimadzu公司)。

1.3 藥品與試劑

青霉素/鏈霉素溶液(批號：KGY002)、0.25%胰蛋白酶-EDTA細胞消化液(Trypsin-EDTA)(批號：KGY001)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(批號：KGB500)、Braford蛋白含量檢測試劑盒(批號：KGA801)和全蛋白抽提試劑盒(批號：KGP250)均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清(FBS)(美國ExCell Biology公司，批號：FSS500)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：12800-082)；(上海ExCell公司)；1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；大黃素(美國Sigma公司)；雷替曲塞(南京正大天晴制藥有限公司，國藥準字：H20090325；規(guī)格：2 mg/支；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Rapid Bio公司)。

1.4 實驗分組

本研究共分為4組，對照組[給予0.1%二甲基亞砜(DMSO)]、雷替曲塞組(給予雷替曲塞)、大黃素組(給予大黃素)和聯(lián)合用藥組(給予大黃素+雷替曲塞)。

1.5 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細胞活力

將PANC-1細胞鋪于96孔板內(nèi)，每孔加入50 μL細胞懸液(約1×104個細胞)，另加入1640培養(yǎng)液50 μL。待細胞充分貼壁后進行實驗，按照不同組別分別給予雷替曲塞、大黃素以及兩藥聯(lián)合處理，干預(yù)72 h后實驗終止。96孔板每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩混勻后，使用酶標儀測量波長為490 nm處的吸光度(OD)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=用藥組平均OD值/對照組平均OD值×100%。

1.6 ELISA法測定白細胞介素(IL)6、IL-1β及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平

分別收集對照組、雷替曲塞組、大黃素組和聯(lián)合用藥組細胞上清液，按照ELISA試劑盒的說明書進行檢測。取出IL-6、IL-1β和TNF-α抗體包被板，將不同濃度的標準品及實驗樣本加入反應(yīng)孔中，并用封板膠紙封閉，37 ℃孵育90 min；舍棄反應(yīng)孔中液體，每孔加入洗滌液350 μL，反復(fù)洗板共5次；除空白孔之外，其余反應(yīng)孔中加入生物素化抗體工作液100 μL/孔，用封板膠紙封閉，37 ℃孵育60 min并反復(fù)洗板；除空白孔外，各反應(yīng)孔中加入酶結(jié)合物工作液100 μL/孔，用封板膠紙封閉，37 ℃孵育30 min后反復(fù)洗板；加入顯色劑，37 ℃避光孵育15 min。加入終止液100 μL/孔，混勻后測量波長為450 nm處的OD值。

1.7 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測PANC-1細胞凋亡情況

(1)將PANC-1細胞消化后，接種至六孔板，待PANC-1細胞貼壁后，根據(jù)不同組別加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組；(2)待各組藥物作用48 h后用0.25%胰酶消化，收集細胞；(3)用PBS洗滌PANC-1細胞2次，收集5×105細胞；(4)每孔加入Binding Buffer懸浮細胞500 μL，并加入Annexin V-FITC 5 μL及Propidium Iodide 5 μL混勻；(5)避光反應(yīng)10 min；用流式細胞儀進行檢測細胞凋亡情況(參數(shù)：Ex=488 nm；Em=530 nm)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測胰腺癌細胞內(nèi)ACE2、Ang Ⅱ 表達水平

PANC-1細胞按照不同干預(yù)組，加入相應(yīng)藥物處理后提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度，每個樣品上樣30 g，進行蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，牛奶封閉后順序加入ACE2、AngⅡ、GAPDH一抗(1∶1 000)及二抗(1∶5 000)，到達反應(yīng)時間后，使用ECL試劑盒檢測雜交信號，并計算ACE2、AngⅡ蛋白含量。

1.9 免疫熒光法測定ACE2、AngⅡ蛋白表達情況

將不同干預(yù)組的PANC-1細胞進行免疫熒光細胞化學(xué)染色，觀察各組ACE2、AngⅡ蛋白表達情況。具體流程：(1)PBS反復(fù)洗滌3次，每次5 min；(2)棄去PBS，加入4%多聚甲醛，在37 ℃條件下固定40 min；(3)37 ℃條件下PBS再次洗滌3次，每次5 min；(4)使用0.1% Triton X-100在細胞膜打孔，室溫(25 ℃)下反應(yīng)20 min；(5)加入3% H2O2浸泡，抑制內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下反應(yīng)20 min；(6)37 ℃條件下PBS反復(fù)洗滌3次，每次5 min；(7)加入正常血清封閉液，每孔50 μL，37 ℃，反應(yīng)30 min；(8)去除血清封閉液，直接加入相對應(yīng)的ACE2、AngⅡ一抗；(9)滴加1%BSA按1∶500稀釋的濃縮型FITC和Cye標記二抗，每孔50 μL，37 ℃避光孵育40 min；(10)37 ℃，PBS反復(fù)洗滌3次，每次5 min；(11)滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，稀釋濃度1∶100)，37 ℃避光孵育5 min；(12)沖洗，室溫下PBS洗滌4次，每次2 min；用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝取熒光圖像。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大黃素、雷替曲塞以及聯(lián)合用藥對PANC-1細胞增殖能力的影響

應(yīng)用不同濃度大黃素(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625和0.195 312 5 μmol/L)對PANC-1細胞進行刺激，MTT方法檢測結(jié)果顯示，單用大黃素刺激胰腺癌細胞，隨著大黃素濃度的降低，胰腺癌細胞的抑制率逐漸降低，抑制率由54.53%逐漸降至3.31%，提示大黃素對胰腺癌細胞增殖能力的抑制作用呈劑量依賴性，見表1。應(yīng)用不同濃度雷替曲塞(40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25、0.078 125、0.039 062 5 μg/mL)，MTT方法檢測結(jié)果顯示，單用雷替曲塞刺激胰腺癌細胞，其對胰腺癌細胞增殖能力的抑制作用亦呈劑量依賴性，隨著雷替曲塞濃度的降低，胰腺癌細胞的抑制率由54%逐漸降至8.29%，見表2。根據(jù)IC50，后續(xù)選擇大黃素100 μmol/L、雷替曲塞40 μg/mL進行實驗。PANC-1細胞加藥處理24、48及72 h，大黃素組的PANC-1細胞抑制率分別為11.72%、21.26%及46.73%，雷替曲塞組的抑制率分別為8.40%、19.59%及42.39%，聯(lián)合用藥組的抑制率分別為22.85%、47.75%及68.71%，聯(lián)合用藥組的抑制率高于大黃素組和雷替曲塞組。

表1 不同濃度大黃素對PANC-1細胞的增殖抑制作用Tab 1 Inhibitory effect of different concentration of emodin on the proliferation of PANC-1

表2 不同濃度雷替曲塞對PANC-1細胞的增殖抑制作用Tab 2 Inhibitory effect of different concentration of Raltetrexed on the proliferation of PANC-1

2.2 大黃素、雷替曲塞以及聯(lián)合用藥對PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α水平的影響

使用不同藥物處理72 h時取細胞上清液，分別測定IL-6水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各用藥組PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；雷替曲塞組PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著低于大黃素組，聯(lián)合用藥組上述指標水平顯著低于大黃素組和雷替曲塞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 四組PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較Tab 3 Comparison of IL-6, IL-1β and TNF-α levels in the supernate of PANC-1 cells among four

2.3 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測大黃素、雷替曲塞以及聯(lián)合用藥對PANC-1細胞凋亡的影響

用藥物干預(yù)PANC-1細胞72 h后，各用藥組PANC-1細胞凋亡率均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合用藥組PANC-1細胞凋亡率顯著高于大黃素組和雷替曲塞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1、表4。

表4 四組PANC-1細胞凋亡率比較Tab 4 Comparison of apoptosis rate of PANC-1 cells

2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測大黃素、雷替曲塞以及聯(lián)合用藥對PANC-1細胞ACE2、AngⅡ表達的影響

用藥物干預(yù)PANC-1細胞72 h后，提取細胞蛋白，測定ACE2、AngⅡ蛋白水平。結(jié)果顯示，大黃素組、雷替曲塞組ACE2表達高于對照組，而聯(lián)合用藥組表達最高；大黃素組、雷替曲塞組ACEⅡ的表達低于對照組，而聯(lián)合用藥組表達最低，見圖2、表5。

表5 四組PANC-1細胞ACE2、AngⅡ蛋白水平比較Tab 5 Comparison of ACE2 and AngⅡ protein levels in PANC-1 cells among four groups

A.對照組；B.大黃素組；C.雷替曲塞組；D.聯(lián)合用藥組A.control group; B.emodin group; C.raltitrexed group; D.combination group圖1 四組PANC-1細胞凋亡情況Fig 1 Apoptosis of PANC-1 cells in four groups

圖2 四組PANC-1細胞ACE2、AngⅡ蛋白表達情況Fig 2 Expression of ACE2 and AngⅡ protein in PANC-1 cells of four groups

2.5 免疫熒光法檢測大黃素、雷替曲塞以及聯(lián)合用藥對PANC-1細胞ACE2、AngⅡ表達的影響

從激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果可見，ACE2蛋白陽性表達呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光；ACE2表達部位在胰腺癌細胞的胞漿中，胰腺癌細胞的細胞核中無ACE2表達；大黃素及雷替曲塞單藥組PANC-1細胞ACE2表達高于對照組，聯(lián)合用藥組PANC-1細胞ACE2表達較對照組明顯升高，見圖3。AngⅡ蛋白陽性表達呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光；AngⅡ表達部位在胰腺癌細胞的胞漿和細胞核中；大黃素組、雷替曲塞組PANC-1細胞AngⅡ表達低于對照組，聯(lián)合用藥組PANC-1細胞AngⅡ表達較對照組明顯降低，見圖4。

A. 對照組；B.大黃素組；C.雷替曲塞組；D.聯(lián)合用藥組A. control group; B. emodin group; C. raltitrexed group; D. combination group圖3 四組PANC-1細胞ACE2蛋白表達情況Fig 3 Expression of ACE2 protein in PANC-1 cells of four groups

A. 對照組；B.大黃素組；C.雷替曲塞組；D.聯(lián)合用藥組A. control group; B. emodin group; C. raltitrexed group; D. combination group圖4 四組PANC-1細胞AngⅡ蛋白表達情況Fig 4 Expression of AngⅡ protein in PANC-1 cells of four groups

3 討論

胰腺癌是惡性度較高的腫瘤，具有病程短、進展快速和死亡率高的特點。胰腺癌的治療方案仍值得進一步探索，亟需更為有效的藥物延長患者生存期，提高患者生活質(zhì)量[3]。

雷替曲塞為喹唑啉葉酸鹽類似物，最初由英國Zeneca公司與Royal Mardsen醫(yī)院合作開發(fā)，屬于抗代謝類抗腫瘤藥。雷替曲塞經(jīng)還原葉酸載體攝入細胞被葉酰聚谷氨酸合成酶轉(zhuǎn)化為聚谷氨酸鹽形式貯存細胞中，發(fā)揮更強胸苷酸合酶抑制作用。雷替曲塞聚谷氨酸鹽通過增強TS抑制能力、延長抑制時間而提高其抗腫瘤活性。由于其多聚谷氨酸鹽代謝物的半衰期相對比較長，約為198 h，而常用的化療藥5-氟尿嘧啶(5-FU)的半衰期僅為20 min，因此，雷替曲塞能夠維持較長時間發(fā)揮抗腫瘤作用。雷替曲塞與5-FU的作用靶酶雖然相同，但由于兩者作用部位不同，代謝途徑有差異，不易產(chǎn)生交叉耐藥性，故雷替曲塞可作為胰腺癌5-FU耐藥后的優(yōu)化選擇[4]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素可抑制腫瘤細胞的增殖，其機制包括抗胰腺纖維化[5]，抑制Stat3信號通路，增強表皮生長因子受體抑制劑對胰腺癌細胞的抑制作用[6]，激活凋亡和自噬途徑[7]，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]，下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α[9]，增強5-Aza-CdR對胰腺癌細胞腫瘤抑制基因P16的去甲基化作用等[10]。

本研究系統(tǒng)觀察了大黃素、雷替曲塞單藥及兩者聯(lián)合應(yīng)用對胰腺癌PANC-1細胞的抑制作用。各用藥組PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-6為核因子κB信號通路的下游炎癥介質(zhì)，能通過激活STAT3傳遞信號，阻斷炎癥過程中出現(xiàn)的細胞凋亡，促進微小體形成，促進胰腺癌細胞持續(xù)增殖和遠處轉(zhuǎn)移[11-12]。一項Meta分析研究結(jié)果指出，循環(huán)中IL-6水平有可能是一個獨立的預(yù)后生物標志物，高IL-6水平與短總生存期相關(guān)[13]。下調(diào)IL-6的表達水平，可有助于實現(xiàn)抑制腫瘤的作用。IL-1由腫瘤細胞表達和分泌，可通過小G蛋白Ras誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的激活，可誘導(dǎo)激活蛋白1的激活。高IL-6水平和高IL-1水平的患者表現(xiàn)出整體和無進展生存期縮短，腫瘤控制率降低[13]。本研究結(jié)果顯示，大黃素和雷替曲塞單藥均可有效降低PANC-1細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，上述2藥聯(lián)合應(yīng)用可使其進一步降低，對腫瘤的抑制作用顯著增加。

近年來，臨床腫瘤學(xué)的一個主要目標是促進細胞凋亡，有效殺滅腫瘤細胞。這一程序性細胞死亡過程由多種因素介導(dǎo)，凋亡通路與其他信號機制的相互作用也會影響細胞死亡[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組的PANC-1細胞凋亡率顯著高于大黃素組及雷替曲塞組，提示上述兩藥聯(lián)合應(yīng)用可以產(chǎn)生協(xié)同作用，通過促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。

既往研究結(jié)果證實，ACE2在胰腺中的表達具有保護胰腺作用[15-16]；可抑制胰腺癌細胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移[17-18]。ACE2高表達的腫瘤患者生存期相對更長，而ACE2低表達可作為預(yù)后差的指標之一[16]。下調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸會促進腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[19]。本研究在蛋白水平觀察PANC-1細胞ACE2、AngⅡ表達的變化，結(jié)果證實，各用藥組PANC-1細胞ACE2蛋白水平升高，且聯(lián)合用藥組最高；各用藥組PANC-1細胞AngⅡ蛋白水平降低，且聯(lián)合用藥組最低，與既往研究結(jié)果一致。

中醫(yī)學(xué)中雖無“胰腺癌”的病名，但就其臨床表現(xiàn)，該病屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”“結(jié)胸”和“黃疸”等范疇。中醫(yī)古籍對其病因病機亦有不少論述，如《證治匯補》中記載，“積之始生，因起居不時，憂慮過度，飲食失節(jié)，脾胃虧損，邪正相搏，結(jié)于腹中”?！氨孀C論治”是中醫(yī)治療學(xué)的基本原則。胰腺癌晚期，熱毒血瘀證型較為常見。利用中醫(yī)辨證論治的觀點，針對熱毒血瘀證的胰腺癌患者，特別是對于便秘為主的患者，加強大黃通腑，有利于胃腸功能的恢復(fù)，提高療效。

綜上所述，本研究通過細胞實驗證實了大黃素、雷替曲塞能夠下調(diào)IL-6、IL-1β及TNF-α水平，促進胰腺癌細胞凋亡，實現(xiàn)對胰腺癌PANC-1細胞增殖的抑制作用；兩者聯(lián)合應(yīng)用可起到協(xié)同效應(yīng)，抑制腫瘤細胞增殖的作用更為明顯，其機制可能與上調(diào)ACE2蛋白表達、下調(diào)AngⅡ蛋白表達有關(guān)，可為中西醫(yī)結(jié)合治療胰腺癌提供理論依據(jù)。