李永利,陳 鷹,李 杰

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院 理化分析室,上海市在線檢測(cè)與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201203)

染料木素,又名金雀異黃酮,屬于異黃酮類(lèi)物質(zhì),具有抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松和類(lèi)雌激素樣等生物活性,因此作為功效成分常用于保健食品中[1-2]。現(xiàn)有染料木素的測(cè)定方法主要有液相色譜法[3-4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法[6-7]。這些方法的實(shí)施都依賴(lài)于染料木素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),其測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值準(zhǔn)確度密切相關(guān)。

定量核磁共振法(q NMR)與傳統(tǒng)色譜法相比,主要優(yōu)點(diǎn)在于測(cè)定樣品可以不需要待測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),且快速、準(zhǔn)確,因此被美國(guó)、歐洲、日本和中國(guó)藥典收錄,目前常將絕對(duì)定量模式用于對(duì)照品研究、組分含量測(cè)定和雜質(zhì)控制評(píng)價(jià)中[8-18]。目前,核磁共振技術(shù)在定量分析方法的開(kāi)發(fā)應(yīng)用中經(jīng)常存在如下問(wèn)題:定量峰附近的氫信號(hào)峰因碳-氫偶合效應(yīng)產(chǎn)生衛(wèi)星峰,衛(wèi)星峰容易與定量峰疊加,降低了定量峰信號(hào)的積分準(zhǔn)確度,從而影響分析方法的定量結(jié)果。本工作將反門(mén)控去耦技術(shù)用于核磁共振氫譜(1H NMR)定量研究,解決了相關(guān)衛(wèi)星峰的干擾效應(yīng),提高了氫譜積分準(zhǔn)確度;并確定了q NMR 的采集參數(shù)、去耦功率、內(nèi)標(biāo)物和溶劑,提出了測(cè)定染料木素含量的q NMR 方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Avance 500型核磁共振波譜儀;LC-2030型高效液相色譜儀;MX 5型百萬(wàn)分之一電子分析天平;30-300μL移液器。

香草扁桃酸(GBW 09226)的純度為99.5%;氘代二甲亞砜(DMSO-d6)的純度為99.8%;染料木素對(duì)照品的純度為99.5%,111704- 201703;染料木素樣品,實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器工作條件

采用核磁共振波譜儀在25 ℃下采集1H NMR數(shù)據(jù)。相關(guān)參數(shù)如下:脈沖序列s2pul;去耦方式為反門(mén)控去耦;馳豫延遲時(shí)間40 s;脈沖寬度為90°;掃描次數(shù)32次;空掃次數(shù)4次;采集時(shí)間4.0 s;去耦功率40 d B;譜寬8012.8 Hz。按照上述參數(shù)對(duì)待測(cè)溶液進(jìn)行測(cè)定,以染料木素化學(xué)位移(δ,×10－6)6.38的峰為定量峰,香草扁桃酸δ6.96為內(nèi)標(biāo)信號(hào)峰,將得到的1H NMR 數(shù)據(jù)進(jìn)行傅里葉變換、相位校正、基線校正和積分處理。

1.3 試驗(yàn)方法

精密稱(chēng)取染料木素樣品14.38 mg和香草扁桃酸3.96 mg,用DMSO-d6溶解并定容至2 mL,振蕩均勻,即得供試品溶液。移取300μL供試品溶液至核磁管(5 mm)中,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 氘代溶劑的選擇和染料木素圖譜歸屬

氘代溶劑的選擇主要考慮氘代溶劑對(duì)樣品的溶解度,以及殘留溶劑峰對(duì)定量信號(hào)的干擾程度。試驗(yàn)分別以氘代三氯甲烷(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)、DMSO-d6為氘代溶劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn):CDCl3和CD3OD 都存在溶解性差的問(wèn)題(溶解度都小于5 g·L－1);染料木素和香草扁桃酸在DMSO-d6中均可以較好溶解,且其波譜信號(hào)與殘留溶劑峰沒(méi)有重疊干擾現(xiàn)象。因此,采用DMSO-d6溶解染料木素,采集1H NMR 數(shù)據(jù),并進(jìn)行信號(hào)歸屬,染料木素的信號(hào)峰δ:6.22(d,1H,J＝2.0 Hz,H-6),6.38(d,1H,J＝2.0 Hz,H-8),6.82(d,2 H,J＝8.5 Hz,H-3′,5′),7.37(d,2H,J＝8.5 Hz,H-2′,6′),8.33(s,1H,H-2),9.61(s,1 H,4′-OH),10.90(s,1 H,7-OH),12.96(s,1H,5-OH),如圖1所示。

圖1 染料木素的結(jié)構(gòu)及其在DMSO-d6 中的1 H NMR 譜Fig.1 Structure of genistein and its 1 H NMR spectrum in DMSO-d6

2.2 內(nèi)標(biāo)物和定量峰的選擇

內(nèi)標(biāo)物在q NMR 中需要滿足穩(wěn)定性良好、純度高,與樣品溶解性相似且與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)等要求。分別以鄰苯二甲酸氫鉀、苯甲酸和香草扁桃酸為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明:樣品和鄰苯二甲酸氫鉀的溶解度差別較大,前者在二甲亞砜(DMSO)中溶解度良好,在水中溶解度過(guò)小,后者在水中溶解度較好,在DMSO 中溶解度較差;苯甲酸和香草扁桃酸的溶解性與樣品相似,香草扁桃酸的信號(hào)峰與樣品信號(hào)峰裂分相似。因此,試驗(yàn)選擇香草扁桃酸為內(nèi)標(biāo)物。

定量峰的選擇主要考察峰是否對(duì)稱(chēng)、是否受到干擾。試驗(yàn)選擇染料木素δ6.38為定量峰,香草扁桃酸δ6.96為內(nèi)標(biāo)物信號(hào)峰,如圖2所示。

圖2 香草扁桃酸的結(jié)構(gòu)和信號(hào)峰、染料木素的定量峰Fig.2 Structure and signal peak of vanilmandelic acid,and quantitative peak of genistein

2.3 波譜采集參數(shù)和去耦功率的優(yōu)化

q NMR 的相關(guān)參數(shù)主要包括馳豫延遲時(shí)間、脈沖寬度、掃描次數(shù)和采集時(shí)間。馳豫延遲時(shí)間影響著原子核馳豫,進(jìn)而與信號(hào)峰的積分準(zhǔn)確度密切相關(guān)。試驗(yàn)在不同的馳豫延遲時(shí)間(5,10,20,40,60,80 s)下測(cè)定樣品,并計(jì)算樣品定量峰和內(nèi)標(biāo)物信號(hào)峰的峰面積的比值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)馳豫延遲時(shí)間不小于40 s時(shí),兩者的比值保持穩(wěn)定,因此將馳豫延遲時(shí)間設(shè)置為40 s。脈沖寬度與馳豫延遲時(shí)間共同影響定量峰面積的準(zhǔn)確度。分別將30°,45°,60°,90°設(shè)置為脈沖寬度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)脈沖寬度為90°時(shí),靈敏度良好,故設(shè)定脈沖寬度為90°。

掃描次數(shù)影響信噪比,從而影響定量峰的峰面積。掃描次數(shù)大時(shí),信噪比高,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),因此需要在滿足信噪比和定量峰面積穩(wěn)定的前提下,設(shè)置較小的掃描次數(shù),以縮短檢測(cè)時(shí)間。在1H NMR 測(cè)定中,信噪比與掃描次數(shù)成正比,在馳豫延遲時(shí)間為40 s時(shí),將掃描次數(shù)設(shè)定為16,32,64,128次,計(jì)算樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)物信號(hào)峰的峰面積的比值。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)掃描次數(shù)不小于32次時(shí),比值不再變化,此時(shí)染料木素和內(nèi)標(biāo)物香草扁桃酸的質(zhì)量分別為3.390,4.061 mg。采集時(shí)間是收集信號(hào)變化的時(shí)間,其設(shè)定需要滿足自由感應(yīng)衰減(FID)信號(hào)衰減完全和試驗(yàn)時(shí)間盡可能短的要求。設(shè)置采集時(shí)間分別為1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 s進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),采集時(shí)間為4.0 s時(shí),比值不再變化。因此,掃描次數(shù)設(shè)置為32次,采集時(shí)間設(shè)置為4.0 s。

核磁共振采取反門(mén)控去耦時(shí),去耦器在馳豫延遲期選擇關(guān)閉、在采樣期選擇打開(kāi),這種方式結(jié)合優(yōu)化的去耦功率可以大大減小碳?xì)漶詈闲?yīng)對(duì)定量峰的積分準(zhǔn)確度的影響[15]。去耦功率分別設(shè)置為30,35,38,40,42 dB,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在去耦功率不小于40 dB時(shí),衛(wèi)星峰消失,因此去耦功率設(shè)置為40 dB(圖3)。

圖3 普通1 H NMR 譜和反門(mén)控去耦1 H NMR 譜Fig.3 Ordinary 1 H NMR spectrum and inverse gated decoupling 1 H NMR spectrum

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

用DMSO-d6配制一系列不同質(zhì)量比值的染料木素和香草扁桃酸混合溶液[樣品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量比(mg∶mg)分別 為3.390∶4.061,6.986∶3.275,12.620∶3.802,18.036∶3.778,22.582∶3.010,即0.83,2.13,3.32,4.77,7.50],移 取300μL 至核磁 管中,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。以染料木素的定量峰與香草扁桃酸信號(hào)峰的峰面積比值對(duì)兩者的質(zhì)量比擬合,結(jié)果表明,染料木素與內(nèi)標(biāo)物香草扁桃酸的質(zhì)量比在0.83～7.50內(nèi),與其定量峰和內(nèi)標(biāo)物信號(hào)峰的峰面積比值呈線性關(guān)系。所得零截距線性回歸方程為y＝7.330×10－1x(q NMR 分析中一般線性回歸方程為零截距,與理論斜率值0.733 0一致,可以用于定量分析),非零截距線性回歸方程為y＝7.223×10－1x＋5.280×10－2(用于檢出限的計(jì)算),相關(guān)系數(shù)均為0.999 5。

參照文獻(xiàn)[19],計(jì)算檢出限(3.3s/k),s為非零截距線性回歸方程截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為非零截距線性回歸方程的斜率。所得檢出限為0.2 g·L－1,此時(shí)圖譜中δ6.22,6.38,6.82,7.37和8.33處信號(hào)的信噪比均大于250,滿足歐洲藥典EP10.0 中q NMR檢測(cè)信噪比不小于150的要求。

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 儀器精密度

按照1.3 節(jié)試驗(yàn)方法制備供試品溶液,依照1.2節(jié)儀器工作條件測(cè)定6 次,獲得的圖譜經(jīng)相位校正、積分等處理,待測(cè)物的定量峰與內(nèi)標(biāo)物的信號(hào)峰的峰面積比值分別為2.662,2.662,2.647,2.669,2.670,2.654,比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.33%,說(shuō)明儀器精密度較高。

2.5.2 重復(fù)性

按照1.3節(jié)試驗(yàn)方法制備6份供試品溶液,依照1.2節(jié)儀器工作條件測(cè)定,所得的圖譜經(jīng)處理后得到目標(biāo)峰積分值,計(jì)算染料木素的質(zhì)量分?jǐn)?shù),分別為97.11%,97.01%,96.37%,96.41%,96.52%,96.96%,RSD 為0.34%,表明方法的重復(fù)性較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將供試品溶液在室溫避光條件下保存,分別放置0,3,6,12,24 h后按照1.2節(jié)儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算樣品的定量峰與內(nèi)標(biāo)物信號(hào)峰的峰面積的比值,分別為2.670,2.662,2.669,2.652,2.655,RSD為0.30%,表明供試品溶液在避光條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品分析

精密稱(chēng)取3份染料木素樣品和香草扁桃酸,配制供試品溶液,按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算染料木素的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果分別為96.63%,96.67%,96.44%,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.58%。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23788－2009?保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法 高效液相色譜法?的測(cè)定結(jié)果(染料木素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.21%)相近,表明兩種方法的測(cè)定結(jié)果具有一致性。

本工作以DMSO-d6為溶劑,香草扁桃酸為內(nèi)標(biāo)物,馳豫延遲時(shí)間為40 s、脈沖寬度為90°、掃描次數(shù)為32次和采集時(shí)間為4.0 s,提出了q NMR 測(cè)定染料木素含量的方法,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。采用反門(mén)控去耦技術(shù)采集參數(shù),通過(guò)消除衛(wèi)星峰的干擾提高積分的準(zhǔn)確度,該方法不需要使用待測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分析時(shí)間短,操作簡(jiǎn)便,可作為色譜法的替代方法,用于染料木素的含量測(cè)定,為該類(lèi)物質(zhì)含量分析研究提供新的思路。