周筱慧 李笑妍 褚海辰 董銘心

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，山東 青島 266003； 2 青島大學(xué)藥學(xué)院)

嗎啡作為經(jīng)典的阿片類藥物在臨床上應(yīng)用廣泛，是臨床最有效的鎮(zhèn)痛藥物之一[1-2]。伴隨著嗎啡的長(zhǎng)期應(yīng)用，受體脫敏、藥物耐受等副作用逐漸顯現(xiàn)，明顯降低了嗎啡的鎮(zhèn)痛效果，限制了其臨床應(yīng)用[3]。阿片耐受和痛覺(jué)過(guò)敏的機(jī)制復(fù)雜，其中μ阿片受體(MOR)信號(hào)通路是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，MOR羧基端存在諸多與嗎啡鎮(zhèn)痛活性及副作用相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)。羧基端多位點(diǎn)磷酸化是促使MOR急性脫敏和長(zhǎng)期耐受的關(guān)鍵因素，磷酸化位點(diǎn)缺失的MOR可增強(qiáng)阿片類藥物鎮(zhèn)痛作用[5]?；诖?，本研究針對(duì)MOR羧基端關(guān)鍵磷酸化區(qū)域375STANT379，設(shè)計(jì)合成多肽，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性干擾MOR羧基端關(guān)鍵位點(diǎn)磷酸化，探究受體375STANT379位點(diǎn)磷酸化對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛效果的影響，以期為開(kāi)發(fā)可與嗎啡聯(lián)合應(yīng)用以增強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用的多肽類藥物提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MOR質(zhì)粒由上海聯(lián)慧腦智工程研究中心提供。HEK-293細(xì)胞購(gòu)于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。8周齡成年雌性C57BL/6JNifdc小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，所有小鼠先置于12 h/12 h晝夜環(huán)境中，溫度穩(wěn)定在(23±2)℃，相對(duì)濕度60%，自由進(jìn)食和飲水，7 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多肽的設(shè)計(jì) 通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并同時(shí)確認(rèn)MOR的完整序列。針對(duì)關(guān)鍵磷酸化區(qū)域375STANT379氨基酸序列，設(shè)計(jì)多肽TAT-Q368-T379。為完整囊括關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)，多肽活性部分設(shè)計(jì)覆蓋MOR羧基末端368～379氨基酸序列(QNTREHPSTANT)；為使多肽能穿透多個(gè)生物膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮預(yù)期功效，多肽N端添加穿膜序列TAT(YGRKKRRQRRR)協(xié)助功能序列穿膜。

1.2.2多肽固相合成 采用標(biāo)準(zhǔn)多肽固相合成方法，將Fmoc保護(hù)氨基酸在Rink amide-MBHA Resin樹脂上逐步偶聯(lián)合成多肽。使用高效液相色譜(HPLC)在Posotisil C18半制備柱上對(duì)多肽進(jìn)行純化，流動(dòng)相條件設(shè)置為：水相為去離子水+體積分?jǐn)?shù)0.000 5的三氟乙酸，有機(jī)相為乙腈+體積分?jǐn)?shù)為0.000 5的三氟乙酸。采用HPLC檢測(cè)多肽純度，高分辨質(zhì)譜法(HRMS-ESI)檢測(cè)多肽的相對(duì)分子質(zhì)量，驗(yàn)證無(wú)誤以后，將多肽凍干，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清(FBS)和體積分?jǐn)?shù)0.01抗生素(100 000 U/L青霉素和100 μg鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代。應(yīng)用陽(yáng)離子聚合物類轉(zhuǎn)染試劑sinofection將含有血凝素標(biāo)記的MOR質(zhì)粒(HA-MOR)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)多肽對(duì)細(xì)胞的毒性作用 將轉(zhuǎn)染完成的HEK-293細(xì)胞接種在96孔板中，每孔104個(gè)細(xì)胞，待24 h后細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F組，分別加入終濃度為0、0.5、1.0、10.0、50.0、100.0 μmol/L的多肽100 μL，孵育24 h后，每孔再加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處反應(yīng)體系的吸光度。細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.2.5熱板法檢測(cè)嗎啡鎮(zhèn)痛效果 將小鼠隨機(jī)分為A～F組，實(shí)驗(yàn)前先測(cè)量小鼠體質(zhì)量和基礎(chǔ)痛閾。C組小鼠右下腹腹腔注射5 mg/kg的TAT-Q368-T379，D、E、F組小鼠右下腹腹腔分別注射1、5、10 mg/kg的TAT-Q368-T379，自由活動(dòng)1 h后，B、D、E、F組小鼠頸背部皮下注射嗎啡10 mg/kg，A組小鼠頸背部皮下注射生理鹽水10 mL/kg。各組小鼠分別于末次注射后15、30、45、60、90、120、150、180 min采用熱板法測(cè)定疼痛反應(yīng)潛伏期，具體方法為：熱板儀保持(55±1)℃恒溫，將小鼠站立于熱板上，以小鼠接觸熱板到出現(xiàn)舔后足疼痛反應(yīng)的時(shí)間記為疼痛反應(yīng)潛伏期，作為痛閾指標(biāo)。以5～30 s為篩選的閾值，以60 s為最大閾值，即小鼠60 s未出現(xiàn)疼痛反應(yīng)即停止測(cè)量。計(jì)算嗎啡鎮(zhèn)痛反應(yīng)率(MPE)，MPE=[(疼痛反應(yīng)潛伏期-基礎(chǔ)痛閾)/(60-基礎(chǔ)痛閾)]×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TAT-Q368-T379多肽的設(shè)計(jì)與合成

A：結(jié)構(gòu)式，B：HPLC測(cè)定結(jié)果，C：HRMS-ESI測(cè)定結(jié)果

2.2 多肽TAT-Q368-T379的細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A～F組的HEK-293細(xì)胞的存活率分別為(96.20±2.49)%、(102.03±4.07%)、(107.21±0.84)%、(106.63±7.53)%、(104.42±10.15)%、(100.02±16.49)%。Welch方差分析結(jié)果顯示，各組間細(xì)胞存活率比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.3 多肽TAT-Q368-T379對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛效果影響

表1 GEE參數(shù)估計(jì)結(jié)果Tab.1 Parameter estimation results of GEE

當(dāng)矯正組別效應(yīng)與交互作用后，默認(rèn)180 min(time=8)為參照組時(shí)，15 min(time=1)、30 min(time=2)、45 min(time=3)、60 min(time=4)、90 min(time=5)、120 min(time=6)、150 min(time=7)MPE的平均水平分別較180 min組高33.478%、59.299%、59.299%、59.299%、57.111%、50.928%、33.979%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Waldχ2=10.146～84.246，P<0.05),提示矯正不同干預(yù)措施的影響，不同時(shí)間小鼠MPE值不同。為進(jìn)一步探究不同干預(yù)措施在不同時(shí)間對(duì)MPE影響的差異，進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析，P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。簡(jiǎn)單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，在給藥后60～180 min內(nèi)，D、E、F組小鼠MPE值下降速度較B組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組小鼠在給藥后MPE始終維持低水平，與A組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同處理因素對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛效果的影響(χ/%)Tab.2 Effect of different treatment factors on the analgesic effect of morphine (χ/%)

3 討 論

嗎啡是臨床上治療各種急慢性疼痛的常用藥物，而伴隨嗎啡的長(zhǎng)期應(yīng)用，一系列副作用逐漸顯現(xiàn)，患者表現(xiàn)為受體脫敏、藥物耐受、藥物依賴、呼吸抑制、便秘等[6]。MOR是一種抑制性G蛋白偶聯(lián)受體，當(dāng)嗎啡與MOR結(jié)合后，一方面通過(guò)G蛋白通路，抑制腺苷酸環(huán)化酶和cAMP的產(chǎn)生，降低電壓門控Ca2+通道電導(dǎo)，或打開(kāi)內(nèi)向整流K+通道，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛活性[7]。另一方面各種激酶促使MOR磷酸化，招募下游Arrestin蛋白與受體結(jié)合，阻止G蛋白偶聯(lián)導(dǎo)致受體脫敏，同時(shí)促進(jìn)受體內(nèi)化。去磷酸化受體一部分進(jìn)入循環(huán)返回質(zhì)膜恢復(fù)活性，一部分進(jìn)入溶酶體進(jìn)行降解[8]。受體在細(xì)胞膜上表達(dá)降低可促進(jìn)藥物耐受，降低鎮(zhèn)痛效率，因此，MOR磷酸化與嗎啡鎮(zhèn)痛效果存在密切關(guān)系。

MOR羧基末端具有多個(gè)絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)[9]，各位點(diǎn)激活方式不同，而且在MOR激活后也會(huì)引起不同的生物學(xué)效應(yīng)。LAU等[10]通過(guò)定量質(zhì)譜聯(lián)合細(xì)胞生物學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)，375STANT379位點(diǎn)是阿片類藥物誘導(dǎo)MOR磷酸化的關(guān)鍵位點(diǎn)。阿片類藥物作用于MOR以后，介導(dǎo)Ser375位點(diǎn)發(fā)生快速且顯著的磷酸化，并隨后促進(jìn)其他位點(diǎn)的磷酸化，其中包括Thr370、Thr379和Thr376[11-14]；DOLL等[15]開(kāi)發(fā)的Ser375磷酸化抗體，進(jìn)一步驗(yàn)證了該位點(diǎn)磷酸化的重要作用。同時(shí)375STANT379位點(diǎn)磷酸化與β-arrestin-2蛋白招募及MOR內(nèi)吞密切相關(guān)[10]。將375STANT379序列中所有絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)突變?yōu)楸彼?A)以后，β-arrestin-2蛋白招募與MOR內(nèi)吞受到明顯抑制[14，16-17]。研究顯示，即使是375STANT379序列中單一位點(diǎn)的突變，也會(huì)顯著降低與β-arrestin-2蛋白招募相關(guān)的受體內(nèi)吞[10]。受體內(nèi)吞在受體脫敏及藥物耐受中起著關(guān)鍵作用[8，18]。以上生物學(xué)效應(yīng)均在不同程度上對(duì)嗎啡鎮(zhèn)痛效果產(chǎn)生影響，為MOR羧基端375STANT379位點(diǎn)磷酸化與嗎啡鎮(zhèn)痛效果的關(guān)系的研究提供了線索。

由于位點(diǎn)敲除等手段在實(shí)際應(yīng)用上存在困難，因此可以考慮通過(guò)藥物聯(lián)用改善嗎啡鎮(zhèn)痛效果。研究發(fā)現(xiàn)，目前有7 000多種天然多肽在人類生理中起到重要作用，并在機(jī)體內(nèi)扮演著激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、離子通道配體或抗感染藥物等角色[19-22]。同時(shí)，由于多肽藥物具有免疫原性低、組織滲透性好、易于合成和改造、安全性高、不易在組織中蓄積等優(yōu)點(diǎn)，在抗腫瘤、抗菌及慢性代謝性疾病、心血管疾病、免疫疾病等的治療中應(yīng)用廣泛[23]，是臨床常用的聯(lián)用藥物選擇。

本研究針對(duì)375STANT379關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)多肽TAT-Q368-T379，在多肽N端添加穿膜序列TAT，協(xié)助多肽穿膜抵達(dá)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法合成多肽TAT-Q368-T379，操作簡(jiǎn)便，且該多肽易于分離純化、損失小、收率高。HRMS-ESI結(jié)果顯示，多肽相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期值相符，HPLC結(jié)果顯示多肽純度大于96%，提示該多肽合成正確，可以應(yīng)用于細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8法檢測(cè)出的多肽細(xì)胞毒性，經(jīng)Welch方差分析法分析顯示各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TAT-Q368-T379安全范圍較大，不易產(chǎn)生細(xì)胞毒性。小鼠熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多肽預(yù)處理組小鼠嗎啡鎮(zhèn)痛作用時(shí)間較嗎啡組小鼠明顯延長(zhǎng)，而單純多肽組小鼠未見(jiàn)明顯鎮(zhèn)痛作用，提示該多肽與嗎啡聯(lián)用可顯著延長(zhǎng)嗎啡持續(xù)作用時(shí)間，增強(qiáng)了嗎啡鎮(zhèn)痛效果。結(jié)合既往研究結(jié)果進(jìn)行分析，可以推測(cè)多肽進(jìn)入細(xì)胞后通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制MOR磷酸化，阻止了β-arrestin-2蛋白募集及MOR內(nèi)吞過(guò)程，抑制了受體脫敏及耐受等一系列副作用的產(chǎn)生，從而改善了嗎啡鎮(zhèn)痛效果。此機(jī)制尚可進(jìn)一步應(yīng)用β-arrestin-2蛋白募集實(shí)驗(yàn)及受體內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)可將多肽設(shè)計(jì)思路應(yīng)用于其他關(guān)鍵位點(diǎn)作用的研究。

綜上所述，MOR羧基端375STANT379磷酸化區(qū)域與嗎啡鎮(zhèn)痛相關(guān)，本研究設(shè)計(jì)的多肽可作為工具競(jìng)爭(zhēng)性抑制此關(guān)鍵位點(diǎn)磷酸化，從而有效增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛效果。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(文件號(hào)202007C57162202-111027)。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的要求進(jìn)行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of Qingdao University Faculty of Medicine (Approval Letter No.202007C57162202-111027), and all experimental animal protocols were carried out by following the Animal Management Regulations.

作者貢獻(xiàn)：褚海辰、董銘心、周筱慧參與了研究設(shè)計(jì)；董銘心、周筱慧、李笑妍參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byCHUHaichen,DONGMingxin, andZHOUXiaohui. The manuscript was drafted and revised byDONGMingxin,ZHOUXiaohui, andLIXiaoyan. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.