宮內(nèi)慢性缺血缺氧為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病的起源和發(fā)展提供了強(qiáng)大的刺激。宮內(nèi)缺血缺氧可由妊娠母體的不同疾病狀態(tài)如貧血、妊娠糖尿病、妊娠高血壓等引起。母體產(chǎn)前的缺血缺氧導(dǎo)致胎兒獲得氧和能量減少，引起宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，導(dǎo)致子代以后患心血管疾病的易感性增加；如罹患 缺血性疾病，其心肌損傷程度也更重[1]。其機(jī)制主要與宮內(nèi)缺血缺氧改變子代腎素血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)的發(fā)育有關(guān)[2-3]。妊娠期缺氧的子代大鼠成年后心臟RA活化[4]進(jìn)而激活下游細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2進(jìn)而上調(diào)膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的合成，導(dǎo)致心肌纖維化[5]。已有研究探討宮內(nèi)慢性缺氧與雄性后代主動(dòng)脈功能的關(guān)系，該研究表明，宮內(nèi)缺氧導(dǎo)致主動(dòng)脈中的SOD和GSH-Px活性降低，同時(shí)增加血管對(duì)去甲腎上腺素的血管收縮劑反應(yīng)，降低對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)[6]。但是對(duì)宮內(nèi)缺氧誘導(dǎo)心肌氧化應(yīng)激及心肌損傷的持續(xù)時(shí)間及是否存在性別差異未見報(bào)道。本研究建立孕期宮內(nèi)缺氧模型，研究其子代大鼠不同發(fā)育階段心肌內(nèi)損傷及氧化應(yīng)激損傷情況，進(jìn)而探討宮內(nèi)缺氧對(duì)心肌的影響及其可能機(jī)制。對(duì)開展改善缺氧對(duì)胎兒的心肌損傷的治療措施具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 主要試劑MDA、 SOD 活力、GSH-Px活性等的檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為 SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠(2月齡，體重170～230g，雌雄各24只)，購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于福建省泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例實(shí)施細(xì)則》等相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.3 模型建立及分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將雌性與雄性按1∶1的比例置于籠中交配，次日清晨如檢查出陰栓者則判定為成功受孕，記錄為妊娠第1d(Gestation Day，GD1)。妊娠大鼠(n=20)分為常氧組(n=8)和缺氧組(n=12)，被關(guān)在一個(gè)單獨(dú)的籠子里，于通風(fēng)良好，環(huán)境溫度18℃～20℃，相對(duì)濕度50%～60%的環(huán)境內(nèi)，在12h光照/12h黑暗循環(huán)下，定期更換墊料。參照Williams[7]和王振華等[8]實(shí)驗(yàn)方法建立宮內(nèi)缺氧模型：將孕鼠于妊娠第4d置入低壓缺氧箱內(nèi)(氧氣濃度：10%±0.1%)，維持4h，移出后隨機(jī)取4只孕鼠麻醉后抽取動(dòng)脈血行血?dú)夥治鰴z查，判斷造模成功與否。在妊娠第4d至妊娠第21d期間，每天上、下午各一次缺氧處理，每次4h。常氧組孕鼠于同期置于氧含量正常、等體積飼養(yǎng)艙中飼養(yǎng)。所有孕鼠給予正常飲食，分籠待產(chǎn)，自然分娩。取子代雌鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象繼續(xù)飼養(yǎng)，出生體重(Body weights，BW)低于對(duì)照組平均體重超過(guò)2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩幼崽則將納入IH(Intrauterine Hypoxia，IH)組(30只)，后期進(jìn)一步分為產(chǎn)后5d(新生兒，IH1)、產(chǎn)后20d(幼年期，IH2)和產(chǎn)后40d(青春期，IH3)[9]三個(gè)亞組；常氧組孕鼠子代納入對(duì)照組(Control，Con)，分別Con1、Con2、Con3三個(gè)亞組。

1.4 樣本制備子代大鼠飼養(yǎng)至產(chǎn)后5d、產(chǎn)后20d和產(chǎn)后40d，分別留取標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)本采集前禁食12h，測(cè)量體重后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(1mL/kg)麻醉，迅速取出心臟，稱重并記錄，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)[(心重mg/體重g)×103]。

1.5 心肌氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)用心臟組織制成10%勻漿液，經(jīng)離心10min(3000r/min)后，取上清液進(jìn)一步按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)：采用TBA比色法測(cè)定MDA，WST-1法測(cè)定總SOD活性，比色法測(cè)定GSH-Px。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均數(shù)以(χ-±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)及方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組母體缺氧后生化指標(biāo)的比較表1為孕鼠第1次缺氧處理4h后的動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，結(jié)果顯示：缺氧組血Pa02、Sa02較常氧組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血PaCO2、pH值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？梢?，該模型導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)低氧血癥，但沒有酸中毒及二氧化碳潴留，適用于單純?nèi)毖跻蛩氐难芯俊?/p>

表1 孕鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果(n=4)

2.2 宮內(nèi)慢性缺氧對(duì)體重及心臟指數(shù)的影響如表2所示，與常氧組相比，缺氧組在產(chǎn)后第5d的平均體重降低27%(對(duì)照組12.6±0.6 vs 缺氧組9.2±1.0，P＜0.05)(P＜0.05)，于產(chǎn)后第20d，兩組體重?zé)o顯著差別(P＞0.05)，提示子代鼠出現(xiàn)“追趕生長(zhǎng)”現(xiàn)象。兩組心臟重量無(wú)顯著性差異，但缺氧組心臟重量指數(shù)(心臟與體重比，HW：BW)增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺氧組大鼠心臟指數(shù)明顯高于常氧組大鼠(P＜0.05)，顯示 缺氧導(dǎo)致心臟肥大。

表2 缺氧組及常氧組子代大鼠體重(g)及心臟重量：體重比值(g/g)

2.3 宮內(nèi)慢性缺氧致子代大鼠心肌內(nèi)氧化應(yīng)激損傷與常氧組相比，缺氧組心臟組織呈氧化應(yīng)激狀態(tài)，MDA 增加(圖1A)，而抗氧化應(yīng)激能力指標(biāo)總SOD(圖1B)和GSH-Px(圖1C)活力明顯降低(P＜0.05)。如圖1所示，各缺氧組心肌MDA含量分別較常氧組增加了16.8%、15.1%、13.9%；各缺氧組心肌SOD活力明顯降低，產(chǎn)后5d時(shí)下降約20.5%，產(chǎn)后20d時(shí)下降約23.4%，產(chǎn)后40d時(shí)下降約23.4%。各缺氧組GSH-Px活力分別較常氧組降低了23.5%、21.9%、23.3%。MDA、SOD、GSH-Px活力等缺氧組組與常氧組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MDA、SOD、GSH-Px活力等在各缺氧組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

圖1 各組心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)。圖1A：心臟組織MDA(malondialdehyde)含量；圖1B：心臟組織SOD(superoxide dismutase)活力；圖1C：心臟組織GSH-Px(Glutathione peroxidase)活性，與常氧組相比，**P＜0.01。

3 討 論

孕期缺氧導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，本研究以宮內(nèi)生長(zhǎng)受限子代大鼠為研究對(duì)象，選取三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為出生后5d、20d、40d為研究時(shí)間點(diǎn)，分別代表新生期、幼年期和青春期。研究發(fā)現(xiàn)，子代大鼠胎兒期受母體缺氧影響，出現(xiàn)生長(zhǎng)受限，體重減低一直持續(xù)至幼兒期，但是在青春期時(shí)出現(xiàn)“生長(zhǎng)追趕現(xiàn)象”，出生后40d的時(shí)候，缺氧組體重與常氧組無(wú)明顯差異。這與Wang等[10]的研究結(jié)果是一致的。

胎兒起源假說(shuō)認(rèn)為宮內(nèi)環(huán)境的質(zhì)量與我們的基因組成相互作用，以增加晚年患病的風(fēng)險(xiǎn)。許多研究還證實(shí)了胎源性疾病的發(fā)生在性別上存在差異[11-13]。有研究證明宮內(nèi)缺血缺氧誘導(dǎo)的大鼠后代認(rèn)知能力下降在青春期是性別依賴性的，并且可以在成年大鼠中恢復(fù)。Verschuren等[14]研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)缺氧以性別依賴的方式改變了腎血管功能，雌性的血管功能顯示出比雄性更強(qiáng)的收縮、舒張反應(yīng)性。da Silva等[15]研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)缺氧導(dǎo)致雄性后代主動(dòng)脈中的SOD和GSH-Px活性降低，同時(shí)增加血管對(duì)去甲腎上腺素的血管收縮劑反應(yīng)，降低對(duì)血管擴(kuò)張劑(乙酰膽堿)的舒張反應(yīng)。相關(guān)研究還表明，雌性不論是在“追趕性”生長(zhǎng)還是在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，乃至中樞AngⅡ受體的表達(dá)方面都未發(fā)現(xiàn)存在性別相關(guān)的差異。本實(shí)驗(yàn)表明孕期缺氧可導(dǎo)致子代雌性大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷，證實(shí)了宮內(nèi)慢性缺氧對(duì)氧化應(yīng)激方面的影響不存在性別差異。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)MDA、SOD、GSH-Px反映氧化應(yīng)激狀態(tài)。ROS可氧化細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，進(jìn)一步造成功能蛋白損傷、RNA合成受阻，從而引起細(xì)胞衰老和凋亡。物進(jìn)一步代謝產(chǎn)生MDA，因此，MDA水平可間接反映細(xì)胞損傷。SOD、GSH-Px是ROS重要的清除劑，共同將ROS濃度控制在較低的穩(wěn)態(tài)水平[16-17]。胎兒心臟和脈管系統(tǒng)中的氧化應(yīng)激是產(chǎn)前缺氧在以后心血管功能障礙發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)[18]。Giussani等[19]研究發(fā)現(xiàn)用維生素C干預(yù)可改善氧化應(yīng)激損傷宮內(nèi)缺氧孕鼠子代胎兒期、成年雄性大鼠的主動(dòng)脈功能及氧化應(yīng)激狀態(tài)，也確認(rèn)了氧化應(yīng)激是宮內(nèi)缺氧雄性大鼠的血管功能障礙發(fā)生發(fā)展中的重要地位。本研究顯示不同發(fā)育階段的雌性大鼠心肌MDA增加，提示心肌遭受氧化損傷；各缺氧組SOD、GSH-Px活性降低顯示宮內(nèi)缺氧降低了后代心肌內(nèi)的抗氧化能力，以上數(shù)據(jù)與Giussani等的研究結(jié)果是一致的。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)經(jīng)歷慢性宮內(nèi)缺氧的子代雌性大鼠在不同發(fā)育階段的心肌損傷情況及其機(jī)制進(jìn)行探討，這些數(shù)據(jù)為預(yù)防高危妊娠后代心臟功能障礙的發(fā)育起源的機(jī)制和可能的干預(yù)靶點(diǎn)提供了參考。