何 穎 馮傳良 劉進(jìn)營(yíng) 鄭慧敏 江圣杰*

(1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)院特診科, 北京 100034; 2.上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200030;3.河南大學(xué)材料學(xué)院特種功能實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450001)

骨充填生物材料被廣泛運(yùn)用在各類骨缺損修復(fù)，生物材料的多種物理性能，例如硬度、彈性、納米拓?fù)湫蚊驳?，能夠調(diào)節(jié)缺損區(qū)域的干細(xì)胞功能從而引導(dǎo)骨組織再生[1]。 手性是自然界廣泛存在的一個(gè)基本物理特性[2]，前期已有研究[3]報(bào)道了手性能夠調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化命運(yùn)，同時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞的極化命運(yùn)也有顯著的調(diào)控作用[4]，而其調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制尚不明晰。

線粒體廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，其參與完成了多種細(xì)胞功能，包括三羧酸循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換、鈣離子儲(chǔ)存等，其生物功能的復(fù)雜性也使得其對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化起著不可或缺的作用[5]。

本實(shí)驗(yàn)將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)聯(lián)合高通量分析和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)闡明手性三維微環(huán)境介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體功能調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 三維干細(xì)胞培養(yǎng)方法

左旋右旋三維苯丙氨酸水凝膠由上海交通大學(xué)馮傳良課題組制備。將凝膠因子粉末加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液中，混合均勻至粉末完全溶解，制成凝膠因子DMSO 儲(chǔ)備液。SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(RASMX-01001)與SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(RAXMX-90011)購置于賽業(yè)生物科技有限公司，將手性儲(chǔ)備液加入至細(xì)胞密度為 100萬/mL的細(xì)胞懸液中，迅速用移液槍轉(zhuǎn)移至 24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入量為 500 μL。然后將 24 孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞孵育箱內(nèi)，待凝膠形成，再加入培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，每2 d更換新鮮培養(yǎng)基。該實(shí)驗(yàn)于北京大學(xué)口腔醫(yī)院完成。

1.2 免疫熒光染色

使用手性水凝膠對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)進(jìn)行三維培養(yǎng)。在細(xì)胞接種后的第3天，使用直接法對(duì)手性基質(zhì)中的 MSCs 進(jìn)行線粒體的膜電位進(jìn)行免疫熒光染色。染色時(shí)首先吸去 24 孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，用 PBS 溶液浸洗。然后分別加入使用PBS 配為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA 溶液按相應(yīng)比例稀釋后的線粒體深紅色熒光探針和線粒體綠色熒光探針染色。利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察、拍照。

1.3 大鼠顱骨缺損模型的建立及骨再生實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證左旋三維微環(huán)境中細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)，使用健康的5周齡SD大鼠建立顱骨缺損模型。首先用為 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠。待麻醉后，術(shù)區(qū)備皮，切開，剝離骨膜，使用環(huán)鉆在顱骨上打孔，使顱骨左右兩側(cè)分別形成對(duì)稱的直徑約5 mm的缺陷。將在手性水凝膠基質(zhì)中培養(yǎng) 3 d的 MSCs(1 000萬細(xì)胞/mL)注射到新形成的大鼠顱骨缺損中，然后用不可吸收膜覆蓋以引導(dǎo)組織再生。每個(gè)缺損處總注射體積為100 μL。縫合。術(shù)后對(duì)大鼠使用青霉素以預(yù)防感染。在3 d后，通過吸入 CO2處死大鼠并手術(shù)分離顱骨樣本。利用組織學(xué)檢查來分析樣品。

1.4 組織切片免疫組織化學(xué)法染色

40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲醛對(duì)分離出來的顱骨標(biāo)本固定，EDTA搖床脫鈣14 d，包埋，切片，微波加熱免疫組化抗原修復(fù)，緩沖液洗3 min，2次，在過氧化氫阻斷劑(Abcam公司，美國，ab64218)中孵育 10 min使得免疫組化背景封閉，緩沖液洗5 min，2次，滴加非特異性背景染色處理劑，在室溫下孵育 5 min以封閉非特異性的背景染色，緩沖液洗5 min，2次。CXCL2一抗(Abcam公司，美國，ab9777)孵育2 h，緩沖液洗5 min，2次，增強(qiáng)子室溫孵育20 min，緩沖液洗5 min，2次，滴加酶標(biāo)二抗，室溫孵育30 min，緩沖液漂洗5 min，向1 mL過氧化氫緩沖液中滴加2滴3,3-二氨基聯(lián)苯胺加強(qiáng)顯色液體(DAB 底物試劑盒，ThermoScientific公司，美國，34065)，混勻后滴加到切片上，孵育15 min。自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.5 高通量測(cè)序與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

RNA文庫構(gòu)建使用RNA文庫制備試劑盒(Illumina?公司，美國)，按照廠家的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行，樣本送至博奧晶典 (北京)公司進(jìn)行測(cè)序，使用 NanoDrop 測(cè)定 RNA 濃度，凝膠電泳監(jiān)測(cè)樣本RNA的完整性，完成樣本質(zhì)檢后利用 oligo-dT磁珠從總RNA分離具備poly-A 尾RNA，即mRNA。 mRNA經(jīng)過片段純化后，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈與第二鏈，并且對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物末端修補(bǔ)為平末端，然后在3′末端加A。連接產(chǎn)物經(jīng)過純化，去除連接不完整的產(chǎn)物以及空的接頭自連產(chǎn)物，運(yùn)用與接頭序列互補(bǔ)的通用引物對(duì)純化樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化去除引物二聚體、瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢以及濃度測(cè)定后，將濃度統(tǒng)一調(diào)整為 2 nmol/L，RNA文庫構(gòu)建即告完成后上機(jī)測(cè)序。利用通路可視化軟件繪制京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)線粒體氧化代謝通路的可視化。對(duì)2 090個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行富集分析，其中有146個(gè)差異基因注釋到本文中的6個(gè)基因功能條目。相關(guān)結(jié)果圖通過R軟件進(jìn)行繪制。利用超幾何分布進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)得到富集結(jié)果的P值，利用BH進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)，校正P值，得到CorrectedP值，CorrectedP值越低富集結(jié)果越顯著。利用Limma包進(jìn)有生物學(xué)重復(fù)或配對(duì)的差異比較，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2FC|≥1且P值≤0.05。

2 結(jié)果

2.1 線粒體膜電位檢測(cè)

在三維手性微環(huán)境中，間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體線粒體深紅色熒光探針和線粒體綠色熒光探針雙染標(biāo)記分析結(jié)果顯示左旋微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體線粒體深紅色熒光與線粒體綠色熒光比例更高，并對(duì)左旋組和右旋組中20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行熒光比值定量分析，左旋組也顯著高于右旋組，表明左旋微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體膜電位穩(wěn)定，而在右旋組中線粒體深紅色熒光與線粒體綠色熒光比例較低，右旋三維微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體膜電位功能受損(圖1)。

圖1 三維手性微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體膜電位染色Fig.1 Mitochondrial potential staining of mesenchymal stem cells in three-dimensional chiral microenvironment

2.2 組織學(xué)染色CXCL2趨化因子的表達(dá)

對(duì)大鼠顱骨缺損模型進(jìn)行免疫組化切片染色，左旋水凝膠植入后在缺損區(qū)域促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)表達(dá)更多趨化因子CXCL2，而在右旋水凝膠植入后缺損區(qū)域CXCL2的表達(dá)明顯更低(圖2)。

2.3 KEGG線粒體膜功能可視化分析

通過對(duì)三維微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體膜氧化磷酸化功能KEGG信號(hào)通路可視化分析，對(duì)3 d樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)多種線粒體表面膜蛋白發(fā)生了顯著改變，特別是NADH相關(guān)酶活性Ndufa4出現(xiàn)顯著改變，佐證了三維手性微環(huán)境改變會(huì)造成干細(xì)胞內(nèi)線粒體膜功能的調(diào)整從而激活下游信號(hào)(圖3)。

2.4 GO功能分析解析線粒體相關(guān)功能改變

通過對(duì)三維微環(huán)境中培養(yǎng)3 d的間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能信號(hào)通路氣泡圖分析，發(fā)現(xiàn)多種線粒體功能發(fā)生了顯著改變，包括線粒體組裝、線粒體形態(tài)、線粒體降解、線粒體膜離子運(yùn)輸?shù)?圖4)。

圖2 三維手性水凝膠結(jié)合間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)植入組化染色Fig.2 Histochemical staining of three-dimensional chiral hydrogel combined with mesenchymal stem cells in vivo

圖3 KEGG線粒體氧化代謝通路可視化Fig.3 Visualization of KEGG mitochondrial oxidative metabolic pathway

圖4 GO線粒體相關(guān)功能分析Fig.4 GO mitochondria related function analysis

2.5 線粒體降解功能相關(guān)基因表達(dá)

通過對(duì)三維微環(huán)境中培養(yǎng)3 d的間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中多個(gè)線粒體降解相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ulk1、Stom、Map1、Vdec、Hlk2、Fundc2和Hsf2bp都出現(xiàn)了在右旋組表達(dá)上調(diào)，證明右旋微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體出現(xiàn)了降解(圖5)。

圖5 線粒體降解相關(guān)基因表達(dá)熱圖分析Fig.5 Heat map analysis of mitochondrial degradation related gene expression

3 討論

在生物發(fā)生過程中建立協(xié)調(diào)的組織和器官是最基本的生物學(xué)過程之一，而干細(xì)胞異質(zhì)性在其中起著至關(guān)重要的作用[6]。 作為支持胚胎主要結(jié)構(gòu)的重要功能器官，人體骨組織來源于位于近軸/體周中胚層的干細(xì)胞[7]。此外，這些細(xì)胞還可以分化成其他譜系，包括脂肪細(xì)胞、真皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞[8]。了解干細(xì)胞命運(yùn)的異質(zhì)性發(fā)育機(jī)制對(duì)于產(chǎn)生這些重要結(jié)構(gòu)和闡明先天性疾病的病因至關(guān)重要。

手性是指兩個(gè)物質(zhì)之間具備鏡像的關(guān)系例如人的左右手，結(jié)構(gòu)相似，但不能夠完全疊合。手性如同硬度、彈性等是廣泛存在于自然界的一個(gè)基本物理特性，大到天體的運(yùn)動(dòng)，小到蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)，都具備手性特征[9]。而在生物材料領(lǐng)域，如何賦予材料手性這一特征，優(yōu)化生物材料物理性能，提高骨缺損區(qū)植入的再生效率，仍需更深的研究討論。細(xì)胞行為與功能對(duì)細(xì)胞外環(huán)境的手性選擇與規(guī)律不僅是生命起源的重大科學(xué)問題，也啟發(fā)了再生醫(yī)學(xué)支架材料活性功能設(shè)計(jì)。

線粒體對(duì)于干細(xì)胞分化尤為重要，現(xiàn)有研究[10]證明不同干細(xì)胞中線粒體豐度、形態(tài)和功能存在不同的變化，并且已經(jīng)確定線粒體生物發(fā)生和氧化磷酸化的代謝轉(zhuǎn)變是MSC分化的標(biāo)志。除了在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮重要作用外，線粒體也是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化需要廣泛的表觀遺傳重塑，包括通過甲基化、乙?；吞腔瘉碚{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的共價(jià)組蛋白或DNA修飾。研究[11]表明，細(xì)胞代謝的代謝中間產(chǎn)物需要作為表觀遺傳調(diào)節(jié)劑的輔因子，在線粒體代謝和基因表達(dá)之間提供直接聯(lián)系。然而，對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)如何調(diào)控干細(xì)胞線粒體功能從而調(diào)控干細(xì)胞分化的直接影響知之甚少，目前已有研究證明細(xì)胞能夠識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)，將環(huán)境信號(hào)傳遞到線粒體再繼續(xù)呈遞到下游[12]。

研究[13]顯示右旋三維微環(huán)境中干細(xì)胞線粒體膜電位出現(xiàn)了早期損傷的表現(xiàn)，線粒體膜電位損傷是線粒體凋亡的早期表現(xiàn)，當(dāng)干細(xì)胞線粒體功能出現(xiàn)障礙后，會(huì)影響干細(xì)胞分化功能。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)在左旋材料植入早期，缺損區(qū)域干細(xì)胞分泌更多的CXCL2因子，CXCL2是干細(xì)胞識(shí)別的趨化因子，其功能作用廣泛，能夠促進(jìn)細(xì)胞的糖酵解活性和線粒體呼吸，由此看出在體內(nèi)三維微環(huán)境中右旋微環(huán)境也不利于細(xì)胞的線粒體代謝途徑。

通過高通量測(cè)序的深入分析，本研究發(fā)現(xiàn)左旋三維微環(huán)境能夠顯著上調(diào)線粒體NADH脫氫酶的表達(dá)，以往研究[14-15]報(bào)道線粒體NADH脫氫酶活性抑制會(huì)造成線粒體功能損傷，這也與本研究結(jié)果相吻合。本研究中右旋微環(huán)境中NADH脫氫酶活性降低，表明右旋微環(huán)境中干細(xì)胞線粒體功能在早期已經(jīng)出現(xiàn)障礙。本研究又對(duì)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)手性微環(huán)境不同線粒體組裝、線粒體形態(tài)、線粒體降解、線粒體膜蛋白定位，線粒體膜鈣離子運(yùn)輸，線粒體軸突轉(zhuǎn)運(yùn)等功能也會(huì)出現(xiàn)差異，證明了手性微環(huán)境對(duì)細(xì)胞線粒體功能調(diào)控顯著。同時(shí)，在右旋微環(huán)境中線粒體降解相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，表明線粒體在右旋微環(huán)境中開始凋亡。

本研究的前期研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，左旋微環(huán)境利于干細(xì)胞成骨分化，在本研究中找到了三維手性微環(huán)境調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵途徑，左旋微環(huán)境中干細(xì)胞的線粒體NADH脫氫酶表達(dá)上調(diào)，線粒體代謝功能增強(qiáng)，幫助了間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化，而右旋微環(huán)境中干細(xì)胞的線粒體降解凋亡增多，線粒體膜電位受損，不利于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨方向分化。綜上所述，手性三維微環(huán)境可以調(diào)節(jié)植入干細(xì)胞的線粒體功能從而參與干細(xì)胞的分化命運(yùn)，其中左旋微環(huán)境通過對(duì)細(xì)胞線粒體相關(guān)基因的調(diào)控，有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，對(duì)成骨有促進(jìn)作用，在治療骨缺損方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可以為臨床研究和應(yīng)用提供依據(jù)和參考。