彭思婕，張立強(qiáng)，郭 佳，敖宗華，周燕妮，任劍波，彭遠(yuǎn)松

（1.四川輕化工大學(xué)，四川自貢 643002；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646099；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646099）

我國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的白酒，是世界六大蒸餾酒之一，歷史悠久、香型眾多、口味各異。清香型白酒因具有清香純正、醇甜柔和、余味凈爽等風(fēng)格特征廣受消費者青睞?！叭糇骶契罚瑺栁┣Y”，大曲作為蒸餾酒釀造的糖化發(fā)酵劑、菌劑和酶制劑，是釀酒發(fā)酵的原動力，因此大曲品質(zhì)對白酒釀造及質(zhì)量有極大的影響。研究表明，適當(dāng)提高制曲溫度，有利于豐富大曲的焙烤香氣、提高質(zhì)量。在曲藥發(fā)酵過程中，淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等在微生物酶的作用下分解為還原糖、氨基酸和高級脂肪酸等，在較高的發(fā)酵溫度下，這些物質(zhì)進(jìn)一步熱降解或發(fā)生非酶促化學(xué)反應(yīng)，形成烤焙香氣和各種環(huán)類化合物，如2,5-二甲基吡嗪、苯乙醛等。周平等率先開展了熱處理大曲對釀酒影響的實驗，發(fā)現(xiàn)熱處理大曲可豐富白酒的風(fēng)味和提升白酒的質(zhì)量。周榆林等將經(jīng)高溫工藝處理的強(qiáng)化大曲用于生產(chǎn)醬香型白酒，綜合釀造過程和白酒感官理化分析，認(rèn)為加熱強(qiáng)化大曲有利于提升醬香型白酒的品質(zhì)。采用高溫大曲發(fā)酵的醬香型、芝麻香型白酒具有典型的濃郁焦香，舒適感極佳。大曲經(jīng)高溫處理，在一定程度上對微生物進(jìn)行篩選，使得發(fā)酵過程中的耐高溫微生物富集，賦予白酒獨特的焦香、烘焙香。因此，推測高溫制曲與舒適的熟料香氣的產(chǎn)生存在一定關(guān)聯(lián)性。在大曲制造過程中，微生物的代謝產(chǎn)物和原料的分解產(chǎn)物可直接或間接地構(gòu)成白酒的風(fēng)味物質(zhì)，熱處理方式在一定程度上對大曲發(fā)酵及大曲微生物富集產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響白酒的風(fēng)味及品質(zhì)。

本研究將經(jīng)過加熱熟化方式預(yù)處理的制曲原料（小麥）應(yīng)用于大曲的發(fā)酵，曲再熟用于清香型白酒的發(fā)酵，從理化指標(biāo)、揮發(fā)性成分及感官評價等幾個維度分析加熱熟化小麥制曲對大曲發(fā)酵及清香型白酒品質(zhì)的影響，為大曲生產(chǎn)工藝改進(jìn)及調(diào)味酒生產(chǎn)提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：小麥，市購南方軟質(zhì)小麥。

試劑：無水乙醇、可溶性淀粉、葡萄糖、酒石酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、五水硫酸銅等均為分析純，購自聚合化工；2-辛醇、己酸乙酯、己酸均為色譜純，購自上海阿拉丁生化科技有限公司。

儀器：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC/MS-QP2020，日本島津公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9245A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；自動控溫電磁炒藥機(jī)：XCYZ-900，臺州博大制藥機(jī)械有限公司；蒸汽夾層鍋：諸城市新尊食品機(jī)械有限公司；恒溫水浴鍋：HWS-12，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲的制備

對照曲制備：整粒小麥潤麥后粉碎，加水拌和均勻，壓制成型，入庫安曲，保溫培菌，發(fā)酵15 d 左右進(jìn)行翻曲，發(fā)酵30 d 后，轉(zhuǎn)入貯曲室，儲存2 個月，得到成品曲。

熟曲制備：取360 kg整粒小麥，150 ℃炒制30 min后粉碎，備用。取240 kg 整粒小麥粉碎，加360 kg水，蒸煮升溫至75 ℃即可，放置至室溫，備用。將炒制后和蒸煮后的物料加水拌和均勻，壓制成型，入庫安曲，保溫培菌，發(fā)酵15 d 左右進(jìn)行翻曲，發(fā)酵30 d后，轉(zhuǎn)入貯曲室，儲存2個月，得到成品曲。

1.2.2 取樣方法

從曲房的5 個不同位置隨機(jī)取5 塊發(fā)酵0 d、3 d、6 d、9 d、15 d、20 d、25 d、30 d、40 d、50 d、60 d、70 d、80 d、90 d 的大曲，將大曲粉碎后，混合均勻，取500 g 分裝到無菌自封袋中，儲存于-20 ℃，用于后續(xù)實驗分析。

1.2.3 清香型白酒釀造

熟曲和對照曲用于釀造清香白酒，工藝流程如圖1。

圖1 試驗釀造清香白酒工藝流程

1.2.4 大曲溫度、理化及酶活檢測

大曲溫度測定方法：每組大曲隨機(jī)挑選3 塊，將溫度計從曲塊的側(cè)面中央位置插入至曲心位置，從入房到翻曲期間，溫度變化較快，每天記錄一次溫度，翻曲后至發(fā)酵30 d，每5 d 記錄一次溫度，發(fā)酵30 d后，每10 d記錄一次溫度。

大曲水分含量、酸度、淀粉含量、糖化力、液化力、發(fā)酵力測定均參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》；酯化力測定參照《釀酒分析與檢測》。

1.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測

大曲樣品的前處理：準(zhǔn)確稱取2.0 g 大曲樣品于20 mL 頂空瓶中，加入1 顆磁力攪拌轉(zhuǎn)子，加入5 mL 飽和NaCl 溶液和10 μL 2-辛醇內(nèi)標(biāo)溶液（0.822 mg/mL，溶于色譜級甲醇），置于恒溫加熱磁力攪拌器中，60 ℃預(yù)平衡15 min，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭（Supelco，美國），在60 ℃水浴中萃取45 min。GC-MS進(jìn)樣口250 ℃條件下解吸4 min，進(jìn)行GC-MS分析。

酒樣的前處理：準(zhǔn)確吸取200 μL 酒樣和10 μL 2-辛醇內(nèi)標(biāo)溶液（0.822 mg/mL，溶于色譜級甲醇）加入20 mL 頂空瓶中（預(yù)先加入5 g NaCl），置于恒溫加熱磁力攪拌器中，60 ℃預(yù)平衡15 min，然后插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭（Supelco，美國），在55 ℃水浴中萃取45 min。GC-MS進(jìn)樣口250 ℃條件下解吸4 min，進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱為DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm，安捷倫，美國）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣為高純度氦氣，流速1.0 mL/min；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min升溫速率升溫至220 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：EI電子轟擊電離源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，掃描模式為全掃描，掃描范圍40～400 amu。

1.2.6 大曲感官特征分析

感官檢驗指標(biāo)：外觀、斷面、曲皮厚、曲香，參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中相關(guān)的步驟進(jìn)行。

1.2.7 清香型白酒感官評價

由10 名品酒師，男生5 名，女生5 名，對兩種大曲釀制的清香型白酒感官評價。將感官屬性定義為醇香、水果香、花香、糧食香、甜香、糟香、烘焙香、澀味、苦味、酸味。用5 分法非結(jié)構(gòu)化標(biāo)度進(jìn)行分析，其中0 分表示“不可感知”，5 分表示“強(qiáng)烈可感知”，結(jié)果用平均值表示。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0、OriginPro 2018 等軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱熟化小麥制曲對大曲理化指標(biāo)的影響

測定大曲發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)，如圖2 所示，結(jié)果表明，兩種大曲發(fā)酵溫度整體變化趨勢符合“前緩、中挺、后緩落”規(guī)律。原料經(jīng)熱處理，部分營養(yǎng)物質(zhì)提前分解，且曲塊保有余溫，有利于微生物生長繁殖，發(fā)酵前期，熟曲的整體發(fā)酵溫度較對照曲高。蒸煮處理使原料含水量較高，導(dǎo)致熟曲的入房水分含量高于對照曲。

圖2 大曲發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

發(fā)酵過程中，兩種大曲水分變化趨勢相近，呈先下降后保持不變的趨勢。前15 d，熟曲水分散失速率高于對照曲，可能是發(fā)酵溫度較高所致；其次，原料經(jīng)過熱處理，物料中淀粉等物質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，導(dǎo)致熟曲保水能力不如對照曲。熟曲與對照曲的酸度和淀粉變化趨勢類似，發(fā)酵結(jié)束后，熟曲與對照曲差異較小。熟曲和對照曲還原糖含量變化趨勢類似但差異較大，熟曲還原糖含量明顯高于對照曲。整體上，熟曲的淀粉含量降低速率較對照曲更快，熱處理，特別是蒸煮工序，使原料中的淀粉糊化，更容易分解成麥芽糖、葡萄糖等還原糖，更有利于微生物利用，與羅惠波等的研究結(jié)論一致。兩種大曲的成品曲（90 d）之間，酸度差異不顯著（P＞0.05），溫度、水分含量、還原糖含量和淀粉含量差異顯著（P＜0.05），但均符合成品曲的質(zhì)量要求。

2.2 加熱熟化小麥制曲對大曲酶活力的影響

測定大曲發(fā)酵過程中的酶活力，結(jié)果如圖3 所示，兩種大曲發(fā)酵過程中糖化力（a）、液化力（b）、發(fā)酵力（c）和酯化力（d）變化趨勢不盡相同。兩種大曲的酯化力在發(fā)酵前期急劇上升，熟曲酯化力上升速率較對照曲快，15 d 之后趨于穩(wěn)定。熟曲的糖化力低于對照曲，付萬緒等探究了大曲生產(chǎn)工藝對糖化力的影響，結(jié)果表明，大曲糖化力的高低受原料結(jié)構(gòu)、上霉情況及大火期溫度等諸多因素的影響。本研究中熟曲分解淀粉能力較對照曲弱，推測熟曲前期原料熱處理時，淀粉被提前分解轉(zhuǎn)化；此外，入房發(fā)酵前，對照曲的糖化力高于熟曲的糖化力，表明對照曲因為原料自然接種優(yōu)勢，已具產(chǎn)糖化酶的微生物，而熟曲的原料熱處理使其中產(chǎn)糖化酶的微生物失活導(dǎo)致入房前糖化力極低。經(jīng)高溫期后大曲發(fā)酵力均降低，降幅大，說明酵母不耐高溫。發(fā)酵60 d 之后，熟曲液化力迅速增大，可能是由于發(fā)酵后期，降解淀粉的微生物占據(jù)生長優(yōu)勢或微生物代謝所產(chǎn)降解淀粉的酶累積。發(fā)酵70 d 后，熟曲發(fā)酵力開始上升，說明酵母菌生長代謝和繁殖速度加快，使得酵母菌在發(fā)酵后期占據(jù)優(yōu)勢地位。結(jié)果表明，在發(fā)酵90 d 后，酶活指標(biāo)均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），說明加熱熟化小麥制曲方式對大曲發(fā)酵過程中微生物酶活力影響較大。

圖3 大曲發(fā)酵過程中酶活指標(biāo)的變化

2.3 加熱熟化小麥制曲對大曲揮發(fā)性風(fēng)味的影響

通過HSSPME-GC-MS 對兩種大曲的揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行分析（圖4），在熟曲和對照曲中分別檢測出98 種、83 種揮發(fā)性化合物，主要包括吡嗪類、醇類、酸類、酯類、羰基類化合物，芳香族化合物，烷烴類化合物和其他類化合物等。兩種大曲中芳香族、酯類化合物的豐富度較高，其次為醇類、羰基類、吡嗪類、烷烴類和其他類化合物。熟曲中吡嗪類、醇類、酸類、酯類和羰基類物質(zhì)含量較對照曲高，尤其是吡嗪類物質(zhì)含量，達(dá)（1.807 ±0.017）μg/g；對照曲中含量最突出的是芳香族化合物，為（1.625±0.025）μg/g，其中苯乙醇含量最高。經(jīng)Venn 分析發(fā)現(xiàn)（圖5），兩種大曲共有揮發(fā)性化合物僅50 種，兩種大曲自身所特有的物質(zhì)種類及含量差距較大，從一定程度上可說明加熱熟化小麥制曲工藝對曲藥風(fēng)味物質(zhì)種類及含量具有較大影響。

圖4 兩種大曲揮發(fā)性物質(zhì)中不同化合物的種類（a）及相對含量（b）

圖5 兩種大曲揮發(fā)性化合物種類Venn分析

熟曲中相對含量占比最高的是吡嗪類化合物，兩種大曲的吡嗪類物質(zhì)含量見表1，呈炒豆香、咖啡香、烤面包香的2,5-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪在熟曲中的含量均是對照曲的1倍；對照曲、熟曲中2,3-二甲基吡嗪含量接近；2,3,5,6-四甲基吡嗪在熟曲中含量高達(dá)（1.373±0.147）μg/g，對照曲中僅有（0.232±0.005）μg/g。說明對制曲原料進(jìn)行熱處理可以增加大曲中有堅果香、焦香、焙烤類香氣的吡嗪類物質(zhì)的種類和含量。

表1 兩種大曲吡嗪類物質(zhì)的含量及感官特征比較

熟曲中的醇類物質(zhì)和羰基類物質(zhì)的種類、含量較對照曲高，羰基類物質(zhì)可與酯類物質(zhì)構(gòu)成大曲獨特曲香，這些風(fēng)味物質(zhì)可在微生物降解淀粉、糖酵解過程中尤其是酵母的作用下產(chǎn)生；醇類物質(zhì)主要由酵母菌生成，醇類含量在一定程度上可反映大曲發(fā)酵中酵母菌的代謝情況，與發(fā)酵后期試驗大曲發(fā)酵力上升結(jié)果一致。

2.4 兩種大曲的感官特征比較

依據(jù)《釀酒大曲通用分析方法》中的相關(guān)步驟，對所制大曲的外觀、斷面、曲皮厚、曲香進(jìn)行評價，結(jié)果如表2 所示。熟曲的曲香更濃厚，帶有較濃的豆豉香、發(fā)酵香、堅果香和可可香，對照曲具有大曲糧香、淡弱生腥味、干蘑菇味和陳味；熟曲中心有輕微燒心情況，可能是發(fā)酵前期曲藥水分含量較高所致，且原料磨碎程度為“爛心不爛皮”，曲坯發(fā)酵過程由里向外排水可能會有一定影響。

表2 兩種大曲的感官特征比較

2.5 加熱熟化小麥制曲對白酒酒體風(fēng)味的影響

通過HSSPME-GC-MS 從兩種清香型大曲白酒中共檢測到104 種揮發(fā)性化合物，結(jié)果如圖6 所示，主要包括醇類、酸類、酯類、羰基類、芳香族類、烷烴類和其他類化合物，除乙醇外，含量最高的是酯類物質(zhì)，其種類也最多。兩種大曲清香型白酒共有物質(zhì)59 種，熟曲清香型白酒和對照曲清香型白酒各特有風(fēng)味物質(zhì)20種、23種（圖7）。

圖6 兩種大曲清香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)中不同化合物的種類（a）及含量（b）

圖7 兩種大曲清香型白酒揮發(fā)性化合物種類Venn分析

熟曲清香型白酒和對照曲清香型白酒中的醇類物質(zhì)分別為（215.771±14.218）g/L、（212.817±14.353）g/L，主要以異戊醇、異丁醇、正辛醇和正己醇等為主，其中熟曲清香型白酒中的異戊醇（157.002±7.007）g/L 和異丁醇（15.056±5.072）g/L 含量高于對照曲清香型白酒，適量的高級醇能夠賦予酒體香味，襯托酯香。熟曲清香型白酒中丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、丁二酸二乙酯等較對照曲清香型白酒中含量低，但熟曲清香型白酒中乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、壬酸乙酯等具有典型水果香、花香的酯類物質(zhì)含量均高于對照曲清香型白酒；丁酸、癸酸、壬酸等呈不愉快氣味的物質(zhì)在對照曲清香型白酒中含量更高，愈創(chuàng)木酚、苯甲醛等具有杏仁、堅果和焦醬香的物質(zhì)含量和丁二醇等具有奶油香的物質(zhì)含量則在熟曲清香型白酒中更高。熟曲清香型白酒中還檢測出4-甲基吡嗪（5.665±0.806）g/L，特征香氣為焦香。對照曲清香型白酒中醛酮類物質(zhì)含量更高，為（20.125±6.347）g/L，熟曲清香型白酒中為（17.622±0.421）g/L，醛類物質(zhì)呈花香、水果香、脂肪味，在酒體中主要起到“提揚”香氣和“提揚”入口“噴香”的作用。

2.6 兩種大曲清香型白酒的酒體感官比較

統(tǒng)計品評數(shù)據(jù)，綜合評價兩種大曲清香型白酒的色澤、香氣、口味和風(fēng)格，結(jié)果如圖8 所示，對照曲清香型白酒無色透明，清香風(fēng)格典型，清香純正，酒體醇甜，柔和舒適，余味干凈；熟曲清香型白酒無色透明，糧香明顯，帶有熟獼猴桃果香、奶油香，略帶糠清香，酒體更醇甜，放香好。

圖8 兩種大曲清香型白酒感官品評雷達(dá)圖

3 結(jié)論

檢測大曲發(fā)酵過程中的理化參數(shù)、生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)兩種大曲發(fā)酵過程中的溫度、水分、酸度及淀粉含量的變化趨勢基本一致，還原糖含量的變化趨勢存在差異，熟曲中的還原糖含量要高于對照曲；加熱熟化小麥制曲方式對微生物酶活力影響顯著（P＜0.05），熟曲酶活力整體變化較對照曲滯后，尤其是糖化力低于對照曲。通過HSSPME-GC-MS技術(shù)鑒定出熟曲、對照曲的風(fēng)味物質(zhì)，分別有98種、83 種，熟曲中占比最高的是吡嗪類物質(zhì)，為27.41 %，對照曲中吡嗪類物質(zhì)占比僅11.30 %；同時，基于大曲感官分析，發(fā)現(xiàn)熟曲曲香更濃厚、帶有較濃豆豉香、發(fā)酵香和堅果香；兩種大曲風(fēng)味物質(zhì)種類、含量和感官特征差異明顯，可見對制曲原料(小麥)進(jìn)行加熱熟化處理能影響大曲的風(fēng)味，增加大曲風(fēng)味豐富度。將熟曲應(yīng)用于清香型白酒的生產(chǎn)，通過HSSPME-GC-MS 技術(shù)對所產(chǎn)白酒進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)熟曲清香型白酒風(fēng)味物質(zhì)79 種，對照曲清香型白酒82 種，熟曲清香型白酒中具有甜香、花香、奶油香、焦香的物質(zhì)含量更高，如庚酸乙酯、辛酸乙酯、愈創(chuàng)木酚、4-甲基吡嗪等；對白酒進(jìn)行感官評價，結(jié)果表明，熟曲清香型白酒酒體帶有熟獼猴桃果香、奶油香，酒體更醇甜，放香好。

綜上所述，加熱熟化小麥制曲方式影響了大曲發(fā)酵過程的理化參數(shù)及生化指標(biāo)，改變了大曲及所制清香型大曲白酒的風(fēng)味，熟曲曲香更濃厚、更具特色，熟曲清香型白酒更具甜香、奶油香，酒體整體風(fēng)格評價更高。本研究僅在實驗室條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗，可能對白酒發(fā)酵過程影響較大，因此需在生產(chǎn)實踐上進(jìn)一步研究，為大曲生產(chǎn)工藝開發(fā)及調(diào)味酒生產(chǎn)提供一個新方向。