廖年春， 張瀟迪， 劉 玨

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南省衡陽市 421001)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率排名第2的惡性腫瘤，其病死率在婦科腫瘤中排第1位[1]。目前卵巢癌首選治療方案為外科手術(shù)和術(shù)后以順鉑為基礎(chǔ)的化療，但治療后有約60%的患者會出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)且5年生存率小于45%，復(fù)發(fā)的主要原因是患者對順鉑產(chǎn)生了耐藥性[2]。

miRNA是一種普遍存在于真核生物細(xì)胞中長度約為18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA[3]。miRNA的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、侵襲和凋亡密切相關(guān)[4]。真核生物中存在3種甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)，其中DNMT1主要起維持甲基化的作用,而DNMT3A和DNMT3B主要起形成甲基化的作用[5]。miRNA-200是一個較特殊的miRNA家族,其家族成員在多種腫瘤中參與調(diào)控DNA甲基化[6]。本文觀察miR-200b與miR-200c靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人卵巢癌細(xì)胞株(A2780)和人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株(A2780/DDP)購于長沙麗欣生物有限公司，1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于以色列Biological Industries公司，青鏈霉素混合液(100×)、順鉑購于北京Solarbio公司。完全培養(yǎng)基即RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素雙抗)+10%胎牛血清(FBS)。

miR-200b、miR-200c、U6引物序列、miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒購于上海生工，miR-200b mimics、miR-200c mimics及陰性對照物轉(zhuǎn)染試劑購于吉瑪基因，0.25%胰酶購于美國HyClone，lipo2000購于Invitrogen公司，二甲基亞砜(DMSO)購于德國Sigma-Aldrich，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B抗體購于CST公司，GAPDH抗體購于Bioworld公司，鼠二抗及兔二抗購于美國Sigma公司，miRNA提取分離試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，PCR試劑盒購于賽默飛。

1.2 qRT-PCR檢測miR-200b與miR-200c表達(dá)量

取對數(shù)生長期細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)液，PBS清洗1～2次，miRNA提取分離試劑盒分別提取A2780、A2780/DDP細(xì)胞中總miRNA,采用miRNA第一鏈cDNA合成(莖環(huán)法)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板,用U6作為檢測的內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR測定細(xì)胞中miR-200b與miR-200c水平。引物序列：miR-200b正向引物序列：5′-GCGCATCTTACTGGGCAGC-3′，反向引物序列：5′-AGTGCAGGG TCCGAGGTATT-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA CGACTCCAAT-3′。miR-200c正向引物序列：5′-GCGCGTCTTACCCAGCAGT-3′，反向引物序列：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAC TGGATACGACCCAAAC-3′。U6正向引物序列：5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′，反向引物序列：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；loop-RT引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TCGCACTGGATACGACAAA ATA-3′。PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃ 30 s 1個循環(huán)，隨后94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。分別計(jì)算miR-200b與miR-200c的相對表達(dá)量，結(jié)果采用2-ΔΔCt方法分析。每孔設(shè)置3個平行樣本,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組

取順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37 ℃飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。將2.0×105個/mL的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞達(dá)70%～90%左右按轉(zhuǎn)染試劑說明書對A2780/DDP細(xì)胞株進(jìn)行miR-200b mimics、miR-200c mimics及陰性對照轉(zhuǎn)染，分為si-miR-200b組、si-miR-200c組、si-NC組,轉(zhuǎn)染后放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后換液。轉(zhuǎn)染后1～2天處理細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞IC50值

在6孔板細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，取對數(shù)生長期細(xì)胞,0.25%胰酶消化后移至離心管中,離心收集細(xì)胞并加入培養(yǎng)基制成單個細(xì)胞懸液。加200 μL細(xì)胞接種至96孔板中,使每孔細(xì)胞含量為2 000個,每樣品設(shè)置7個平行濃度，加入濃度梯度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L DDP 48 h后每孔加5 g/L MTT溶液,孵育4 h，繼而每孔加150 μL DMSO并振蕩5 min。酶標(biāo)儀在492 nm處測定達(dá)到預(yù)定時間后的各孔光密度值(OD),用SPSS軟件計(jì)算各組細(xì)胞IC50值。

1.5 Western blotting法檢測轉(zhuǎn)染后DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染48 h后取各組細(xì)胞，在冰上進(jìn)行提取蛋白操作，棄去原培養(yǎng)液，4 ℃預(yù)冷的PBS溶液洗2～3次，每孔加入蛋白裂解液200 μL(RIPA∶PMSF=100∶1)提取總蛋白，取部分蛋白溶液用于BCA測定蛋白水平，按配方配置8%分離膠，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，封閉2 h后分別加入DNMT1、DNMT3A和DNMT3B(均為兔單抗)蛋白稀釋(1∶1 000)后的一抗，GAPDH作為內(nèi)參稀釋(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，12 h后，回收一抗，TBST搖床洗去殘留一抗，10 min/次，洗3次，加入稀釋的兔二抗(1∶5 000)，室溫避光孵育2 h，TBST洗去殘留二抗，10 min/次，洗3次，最后顯影。計(jì)算DNMTs/GAPDH比值,即表示DNMT1、DNMT3A和DNMT3B相對表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞加入DDP室溫孵育48 h，隨后加入Annexin V-PE結(jié)合液混勻,避光室溫孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用Graph Pad Prism8統(tǒng)計(jì)繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 A2780和A2780/DDP中miR-200b與miR-200c的表達(dá)情況

miR-200b與miR-200c在A2780細(xì)胞株的表達(dá)量均明顯高于A2780/DDP細(xì)胞株(P<0.05；圖1)。

圖1 A2780和A2780/DDP細(xì)胞株中miR-200b與miR-200c的表達(dá)量

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞IC50值情況

si-miR-200b組、si-miR-200c組IC50值明顯低于si-NC組(P<0.05；圖2)。

圖2 A2780/DDP細(xì)胞株中各組IC50值比較

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表達(dá)水平情況

si-miR-200b組、si-miR-200c組DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表達(dá)水平低于si-NC組(P<0.05；圖3)。

圖3 A2780/DDP細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白的相對表達(dá)量

2.4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率情況

轉(zhuǎn)染后A2780/DDP細(xì)胞株的各組細(xì)胞隨順鉑濃度的增加，凋亡率逐漸增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在相同濃度藥物處理下，si-miR-200b組、si-miR-200c組凋亡率高于si-NC組(P<0.05)，而si-miR-200b組、si-miR-200c組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率的比較

3 討 論

卵巢癌為婦科三大腫瘤之一，其治療手段一直是研究熱點(diǎn)，近幾年的治療手段也取得了不錯的成果，但術(shù)后的順鉑耐藥仍然是影響卵巢癌患者術(shù)后生存率的重要問題[7]。

miRNA直接或間接調(diào)節(jié)涉及藥物代謝、藥物運(yùn)輸、藥物靶標(biāo)和下游信號分子的基因的表達(dá)[8]。越來越多的研究表明，miRNA可以調(diào)節(jié)藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá),改變腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，從而影響治療效果[8-10]。Lee等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-200家族在EEC中高表達(dá)，并可能在癌癥生長中發(fā)揮重要作用，用抗miR-429轉(zhuǎn)染可以增強(qiáng)EEC中順鉑的細(xì)胞毒活性。Sun等[12]發(fā)現(xiàn)，miR200家族可能通過ZEB1/pSMAD3下調(diào)MMP3，從而抑制了卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Lynch等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-200c和miR-141在前列腺癌中的異常表達(dá)可能作為前列腺癌的診斷和預(yù)后方面的新型生物標(biāo)志物或治療干預(yù)的重點(diǎn)。本文實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在人卵巢癌細(xì)胞株A2780中，miR-200b、miR-200c的表達(dá)均明顯高于人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株A2780/DDP，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)用miR-200b、miR-200c的模擬物對A2780/DDP細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)miR-200b、miR-200c能增強(qiáng)A2780/DDP細(xì)胞對順鉑藥物的敏感性并增加A2780/DDP細(xì)胞的凋亡，表明miR-200b、miR-200c能增加卵巢癌細(xì)胞對順鉑藥物的敏感性并逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞的耐藥性。

近年來表觀遺傳學(xué)備受關(guān)注，主要包括異常DNA甲基化、組蛋白修飾表達(dá)譜以及非編碼RNA表達(dá)等[9]。表觀遺傳改變可通過調(diào)節(jié)參與藥物代謝和分布以及藥物靶標(biāo)的關(guān)鍵基因的表達(dá)來影響藥物治療，從而導(dǎo)致藥物反應(yīng)的個體差異。這些表觀遺傳學(xué)改變以及循環(huán)核酸的表觀遺傳學(xué)特征的發(fā)現(xiàn)，對藥物治療療效的改變，甚至為個性化治療提供生物標(biāo)志物，特別是在癌癥的治療中[10]，具有不可忽視的潛力。DDNMT通常在各種癌癥組織和細(xì)胞系中過表達(dá)。DNA甲基化是可逆的，因此DNMT是藥物開發(fā)的重要表觀遺傳學(xué)靶標(biāo)[14]。DNA高甲基化可能是獲得對順鉑耐藥性的分子機(jī)制之一[15]。癌癥甲基化組中的多個DNA甲基化變化與耐藥性的獲得有關(guān)[15]。在耐順鉑的卵巢癌中觀察到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的顯著上調(diào)[16]。本實(shí)驗(yàn)通過增加A2780/DDP細(xì)胞的miR-200b、miR-200c表達(dá)可顯著抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達(dá)量。

本研究結(jié)果表明，增加miR-200b與miR-200c的表達(dá)可抑制DNA甲基酶的表達(dá)，增強(qiáng)順鉑耐藥細(xì)胞A2780/DDP對DDP的靈敏度，增加卵巢癌細(xì)胞的凋亡，逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株的耐藥性。