蘇 波， 楊詠梅， 劉政海， 何 慧， 蘇 琦

(南華大學衡陽醫(yī)學院 1.藥學院藥物藥理研究所，2.基礎醫(yī)學院應用解剖與生殖醫(yī)學研究所，3.腫瘤研究所，湖南省衡陽市 421001)

脂過氧化物酶(adiporedoxin，Adrx)是過氧化物酶-2(peroxiredoxin-2，PRDX-2)家族成員之一。最初發(fā)現其與破骨細胞分化相關，且具有抗氧化功能[1]。Adrx具有抗脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導巨噬細胞炎癥因子表達作用[2]；He等[3]發(fā)現Adrx在人血管內皮細胞表達，且過表達Adrx抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導的血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表達。

整合素(Integrin)在炎癥反應中介導細胞間的相互作用和跨膜信號轉導，Integrin異常表達與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)、腫瘤發(fā)生和進展等有關[4-6]。本文研究Adrx對TNF-α誘導血管內皮細胞Integrin α4和Integrin β1表達的影響，證實Adrx在血管內皮細胞炎癥反應中對Integrin α4和Integrin β1表達的調控作用。

1 材料和方法

1.1 試劑

人臍靜脈內皮細胞系(human umbilical vein endothelial cell line，HUVEC)(Walkersville，MD公司)，EGM或EGM2(Lonza公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems公司)，SYBR熒光定量PCR檢測試劑盒(ABI公司)，抗Integrin α4和Integrin β1抗體(Abcam公司)，TNF-α、抗Adrx和β-actin抗體(Sigma公司)，二抗和si-Adr(Santa Cruz公司)，Adrx質粒由本實驗室構建[4]。

1.2 細胞培養(yǎng)與細胞轉染

HUVEC在37 ℃、含5%CO2、飽和濕度條件下，置于EGM或EGM2(Lonza公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用電穿孔方法將Adrx質粒和si-Adrx轉染到HUVEC，24 h后用抗Adrx抗體檢測Adrx蛋白，驗證Adrx質粒和si-Adrx轉染效率。建立Adrx過表達細胞株分為對照組、空載體和Adrx組；干擾Adrx表達分為Control、si-Control、si-Adrx組。過表達實驗分為空載體組、空載體+TNF-α組、Adrx+TNF-α組；si-RNA干擾實驗分為si-Control組、TNF-α組、si-Adrx+TNF-α組。

1.3 qRT-PCR

將提取的細胞總RNA逆轉錄合成cDNA；利用Primer Express 4.0設計引物，Integrin α4: F 5′-CAG GTT TAA AGC ATG GCC ACA-3′，R 5′-TGG CAT TGG CAT TGT GTA CC-3′; Integrin β1: F 5′-GCC GCG CGG AAA AGA TGA A-3′，R 5′-TGC TGT TCC TTT GCT ACG GT-3′; β-actin: F 5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′，R 5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。反應條件：95 ℃ 15 s，58 ℃20 s，72 ℃ 20 s，36個循環(huán)；實驗重復3次，β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCT方法進行相對值的定量分析。

1.4 Western blotting檢測

將0.5 mL裂解液加入收集的細胞，置于冰上超聲20 min后，12 000 r/min離心10 min，提取上清液。取等量樣本凝膠電泳后轉移至PVDF膜，室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，洗膜3次后孵育二抗1 h。用化學發(fā)光顯影膠片，灰度掃描后以β-actin作為內對照進行數據分析，計算3次獨立實驗的蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0進行數據分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較用方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 TNF-α對HUVEC細胞Adrx和Integrin α4、Integrin β1表達的影響

用10 μg/L TNF-α處理細胞0、2、4、8、16、24 h，如圖1所示。與0 h組比較，Adrx蛋白水平在2、4 h增高，8 h達到峰值(P<0.05)，16、24 h下降，而Integrin α4和Integrin β1表達水平呈時間依賴性上調；實驗結果顯示TNF-α誘導Adrx表達，但呈現先上調后下降的趨勢，而Integrin α4和Integrin β1表達水平在Adrx下調后明顯升高。

圖1 TNF-α對HUVEC細胞Adrx、Integrin α和Integrin β1表達的影響

2.2 過表達Adrx對TNF-α誘導HUVEC細胞Integrin α4、Integrin β1表達的影響

將Adrx質粒轉染HUVEC細胞24 h，Western blotting結果顯示細胞高表達Adrx(圖2A)。用TNF-α(10 μg/L)處理細胞16 h后，分別檢測Integrin α4和Integrin β1的mRNA和蛋白水平。與單用TNF-α處理的細胞比較，Adrx+TNF-α處理組Integrin α4和Integrin β1的mRNA水平和蛋白表達量顯著下降(圖2)。

圖2 過表達Adrx抑制TNF-α誘導HUVEC細胞Integrin α4和Integrin β1表達

2.3 下調Adrx對HUVEC細胞Integrin α4、Integrin β1表達的影響

將si-Adrx轉染HUVEC細胞24 h，Western blotting結果顯示si-RNA下調Adrx表達(圖3A)。用TNF-α(10 μg/L)處理細胞16 h后檢測Integrin α4和Integrin β1 的mRNA和蛋白水平。結果顯示，與單用TNF-α處理的細胞比較，用si-RNA處理細胞后，TNF-α誘導細胞 Integrin α4和Integrin β1的mRNA水平明顯上調(圖3B)；si-RNA下調Adrx表達后，TNF-α誘導的Integrin α4和Integrin β1蛋白水平增加(圖3C)。

圖3 Adrx-si-RNA增強TNF-α誘導HUVEC細胞Integrin α4和Integrin β1表達

3 討 論

Adrx又稱為巨噬細胞集落刺激因子誘導激活的過氧化物酶-2類分子(PRDX-like 2 activated in M-CSF stimulated monocytes，PAMM)。Xu等[1]報道，在誘導骨髓單核細胞向破骨細胞分化時發(fā)現這個基因，并證實它是一種氧化還原調節(jié)蛋白。過表達Adrx可下調LPS誘導的小鼠巨噬細胞炎性因子IL-1β、IL-6、IL-12表達，表明Adrx對炎癥反應具有抑制作用[2]。

炎癥刺激因子所致的血管內皮細胞功能失調與As發(fā)生發(fā)展密切相關，黏附分子表達增高是內皮細胞炎癥反應的特征之一[7]。He等[3]證實，Adrx抑制TNF-α誘導的血管內皮細胞VCAM-1和ICAM-1表達，同時減少單核細胞與內皮細胞黏附。促炎細胞因子TNF-α促進內皮細胞Integrin α4和Integrin β1表達，后者介導內皮細胞炎癥反應及As進展[8]。本研究發(fā)現，在用TNF-α處理細胞后Adrx表達先上調后降低，與He等[3]的研究結果一致；過表達Adrx可拮抗TNF-α上調Integrin α和Integrin β1表達，而用si-RNA干擾Adrx表達則增強TNF-α上調Integrin α和Integrin β1的作用，表明Adrx負調控Integrin α4和Integrin β1表達。

Adrx分子結構與PRDX-2相似，后者具有抗氧化和抗炎作用。在ApoE-/-小鼠As易感區(qū)內皮組織PRDX-2表達增高；在高膽固醇飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-和PRDX-2-/-雙敲除小鼠，內皮細胞黏附分子表達增加，單核細胞黏附增多并滲入主動脈內膜，從而加速As斑塊形成，表明As發(fā)生與 PRDX-2 表達減少有關[9]。Adrx參與黏附分子和細胞因子的表達調控，它可能具有與PRDX-2相似的抗血管內皮細胞炎癥反應的功能；在TNF-α誘導炎癥反應的過程中，隨著炎癥進展Adrx表達下降可能導致其負調控Integrin α4、Integrin β1作用減弱，而Integrin α4和Integrin β1表達持續(xù)性增高可能促進內皮細胞炎癥反應和As發(fā)展。

Integrin介導腫瘤細胞遷移和轉移[10]。血管內皮細胞Integrin α4和Integrin β1在腫瘤細胞腦轉移的早期表達增高，Integrin α4和Integrin β1功能阻斷抗體可抑制腫瘤細胞腦轉移[11]。VCAM-1在乳腺癌細胞表達異常增高，Integrin α4、Integrin β1與VCAM-1相互作用可促進乳腺癌細胞遠處器官轉移[12]。血管內皮細胞Integrin α4、Integrin β1與腫瘤細胞VCAM-1相互作用不僅介導細胞黏附，還可能增強腫瘤細胞經血管內皮細胞遷移能力。本實驗結果表明，下調Adrx表達可促進TNF-α誘導血管內皮細胞Integrin α4和Integrin β1表達，過表達Adrx則能下調Integrin α4和Integrin β1。由此推測Adrx在血管內皮細胞與腫瘤細胞相互作用中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，它可能通過下調Integrin α4和Integrin β1抑制內皮細胞與腫瘤細胞黏附、影響腫瘤細胞跨血管轉移，而在內皮細胞炎癥反應中Adrx表達下降可能導致Integrin α和Integrin β1上調，后者促進內皮細胞與腫瘤細胞黏附。

本研究證實，Adrx在TNF-α誘導血管內皮細胞Integrin α4和Integrin β1表達中起著負調控作用。目前，Adrx在血管內皮細胞炎癥反應中對黏附分子表達的調控機制尚需進一步的研究。