孫小虎，于 洪，王 璐，艾福錄，白靜慧

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院·遼寧省腫瘤醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110042）

結(jié)直腸癌是全球第四大與癌癥相關(guān)的死亡原因［1］，化學(xué)藥物治療（簡(jiǎn)稱(chēng)化療）常用于治療直腸癌，但化療副作用大，且癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生耐藥性［2］。有研究表明，銀杏內(nèi)酯B 對(duì)癌前病變、原位癌、浸潤(rùn)癌、轉(zhuǎn)移及向遠(yuǎn)端播散階段均顯示出預(yù)防或治療作用［3-4］，且可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［5］?；钚匝酰≧OS）可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移，并可通過(guò)Thr308 磷酸化激活［6-7］。X 連鎖凋亡蛋白抑制劑（XIAP）屬凋亡抑制劑家族成員，位于細(xì)胞質(zhì)中，可作為細(xì)胞凋亡的有效調(diào)節(jié)劑。XIAP 通過(guò)抑制半胱氨酸蛋白酶（caspase）- 3、caspase - 7 和caspase - 9 活性而發(fā)揮抗凋亡作用，且在癌癥化學(xué)耐藥性中起關(guān)鍵作用［8］。此外，ROS 活化可增強(qiáng)XIAP蛋白酶體表達(dá)從而促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖。本研究中探討了銀杏內(nèi)酯B 對(duì)人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及ROS / XIAP 信號(hào)通路的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：Multiskan MK3 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；Transwell 腔室（孔徑8 mm，日本Costar公司，批號(hào)為56324132）；VC - 4785 型顯微鏡（日本Olympus 公司）；FACSCalibur?型流式細(xì)胞儀（日本Sysmex公司）；AB7300型熱循環(huán)儀（美國(guó)ABI公司）；DY?CZ-20H 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；723型紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）。

試藥：RPMI-1640 培養(yǎng)基（批號(hào)為202036269），胎牛血清（FBS，批號(hào)為23654.69），1%青霉素/ 鏈霉素（批號(hào)為41563.36），均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；紫杉醇（批號(hào)為2148.68，含量99.5%），纖維素膜（批號(hào)為BV - 41526563.3），均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；銀杏內(nèi)酯B（批號(hào)為NM-36547，含量99.5%），SDS（批號(hào)為5256363.3），均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scien?tific 公司；四唑鹽（MTT，美國(guó)BioInnovatise 公司，批號(hào)為VB - 41563.36）；基質(zhì)膠Matrigel（美國(guó)BD Biosciences公司，批號(hào)為VC-152696.63）；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)為BC-41521.3），膜聯(lián)蛋白V-EGFP 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為SD - 236548.3），熒光染料DCFH -DA（批號(hào)為741589），均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)為BV -44588.36）；HiScript Ⅱ試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)為DS - 47152.36）；All - in - One?mRNA qRT-PCR 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)GeneCopoeia 公司，批號(hào)為521680）；蛋白酶抑制劑混合物（美國(guó)Calbiochem公司，批號(hào)為XC - 4152336）；BCA 試劑盒（德國(guó)Pierce公司，批號(hào)為415236.36）；anti - XIAP 一抗（1︰1 000，批號(hào)為BH54263），GAPDH 一抗（1︰1 000，批號(hào)為BT48763），免疫球蛋白G 的山羊抗兔二抗（批號(hào)為SX-47152.36），均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)CST 公司，批號(hào)為BD -47125.36），ROS 檢測(cè)試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司，批號(hào)為L(zhǎng)E-2130651）。

細(xì)胞：人結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

取SW480 細(xì)胞適量，接種于含10%FBS 和1%青霉素/ 鏈霉素的RPMI - 1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為模型組（培養(yǎng)基+SW480 細(xì)胞）、紫杉醇組（5 mg/L+培養(yǎng)基+SW480 細(xì)胞）［9］，以及銀杏內(nèi)酯B 低、高劑量組（50，100 μmol/ L + 培養(yǎng)基+SW480細(xì)胞）［10］，各組均培養(yǎng)72 h，每孔設(shè)6個(gè)平行樣。

1.2.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

細(xì)胞存活率：采用MTT 法。取1.2.1 項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞適量，以1 × 104個(gè)/ 孔的初始密度接種于平底96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT，37 ℃、5%CO2條件下孵育4 h，除去培養(yǎng)基，加入DMSO，室溫放置30 min，以酶標(biāo)儀、于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD），以蒸餾水為空白對(duì)照。存活率（%）=（OD用藥組-OD模型組）/（OD用藥組-OD空白對(duì)照）×100%。

細(xì)胞凋亡率：采用流式細(xì)胞術(shù)。取1.2.1 項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞適量，以1.25 × 105mL-1的初始密度接種于6 孔板中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。用PBS洗滌，以初始的密度重懸于1×Annexin V結(jié)合緩沖液中。將100 μL 細(xì)胞懸液與5 μL 膜聯(lián)蛋白（V - FITC）和5 μL碘化丙啶（PI）在黑暗中于室溫下孵育15 min。孵育結(jié)束后添加400 μL 1×結(jié)合緩沖液后，采用流式細(xì)胞儀分析樣品。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

侵襲遷移水平：采用Transwell 法。取1.2.1 項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞適量，以2×104個(gè)/孔的初始密度接種于200 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基中，后移至上腔室，并于底部腔室中加入含10%FBS 的培養(yǎng)基。上腔室涂有或不涂有Matrigel 用于入侵或遷移水平測(cè)定。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞48 h，后以棉簽除去頂部小室中的細(xì)胞，并用甲醇固定下表面細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照。

ROS 水平：采用熒光探針?lè)?。取樣品、?biāo)準(zhǔn)品和DCFH - DA 標(biāo)記的檢測(cè)抗體，依次添加到捕獲抗體的包埋微孔中，溫育并徹底洗滌后，用四甲基聯(lián)苯胺著色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，用光度計(jì)在492 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和每個(gè)孔的OD繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

XIAP mRNA 表達(dá)水平：采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法。取1.2.1項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞適量，以Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參。XIAP、GAPDH 引物由上海Sangon Biotech 公司合成，序列如下，XIAP 正向，5' - CGTAGCTAGCTAGTAGTCGATC?GATCGTAGCTAGCTAGCTAGC - 3'；反向，5' - CG?TAGCTAGTCAGTCGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAG?TCGTG - 3'。GAPDH 正向，5' - CGTAGCTAGCTAGTC?GATCGTAGCTAGCTGACTGTGATCG - 3'；反向，5' -CGTAGCTAGCTAGTCGATCGTAGCTAGCTGATCGATC?GC - 3'。PCR 總反應(yīng)體系（10 μL）為，SYBR Premix Ex Taq 4 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，去離子水4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?6 ℃10 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃10 s，40 個(gè)循環(huán)。讀取循環(huán)閾值（Ct值），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 的表達(dá)量。每組平行實(shí)驗(yàn)3次。

XIAP蛋白表達(dá)水平：采用Westernblot法。取1.2.1項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞適量，加入1 mL RIPA 蛋白裂解液，以BCA 法測(cè)定XIAP 蛋白含量。10% SDS - PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)，4 ℃下與一抗孵育過(guò)夜，棄一抗；室溫下與免疫球蛋白G 的山羊抗兔二抗孵育1 h。加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，將PVDF 膜放入暗盒中，壓上X 膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。以Image J軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，兩兩比較行SNK -q檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率

與模型組比較，紫杉醇組及銀杏內(nèi)酯B 低、高劑量組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2 細(xì)胞凋亡率

與模型組比較，紫杉醇組及銀杏內(nèi)酯B 低、高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。詳見(jiàn)表1及圖1。

2.3 細(xì)胞侵襲遷移水平

與模型組比較，各用藥組細(xì)胞穿膜數(shù)顯著減少（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.4 各組細(xì)胞ROS 水平

與模型組比較，紫杉醇組與銀杏內(nèi)酯B 低、高劑量組細(xì)胞ROS水平顯著降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.5 細(xì)胞XIAP mRNA 及蛋白表達(dá)水平

與模型組比較，紫杉醇組與銀杏內(nèi)酯B 低、高劑量組細(xì)胞XIAP mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組觀察指標(biāo)比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of observed indexes in each group（±s，n=6）

表1 各組觀察指標(biāo)比較（±s，n=6）Tab.1 Comparison of observed indexes in each group（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P < 0.05。Note：Compared with those in the model group，*P < 0.05.

組別模型組紫杉醇組銀杏內(nèi)酯B低劑量組銀杏內(nèi)酯B高劑量組劑量0 5 mg/L 50 μmol/L 100 μmol/L存活率（%）85.52±5.16 29.26±3.18*55.15±2.36*38.45±2.41*凋亡率（%）4.27±0.53 15.14±0.53*8.63±0.55*13.25±0.56*穿膜數(shù)（個(gè)）626.96±32.69 128.26±29.54*418.96±31.62*198.54±30.29*ROS（ng/μL）504.27±35.53 115.14±26.53*418.63±30.55*213.25±27.56*XIAP mRNA 5.93±0.36 1.99±0.23*4.49±0.29*2.98±0.31*XIAP蛋白1.41±0.31 0.39±0.35*1.09±0.33*0.66±0.34*

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)時(shí)常表現(xiàn)為腫瘤轉(zhuǎn)移，術(shù)后易局部浸潤(rùn)和腫瘤復(fù)發(fā)。銀杏內(nèi)酯B 屬內(nèi)酯類(lèi)生物堿，可通過(guò)減弱肝癌細(xì)胞中p38 信號(hào)通路的活性來(lái)阻止細(xì)胞的增殖和侵襲［11］，也可通過(guò)肺癌細(xì)胞中Akt 途徑的失活而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［12］。本研究結(jié)果顯示，50 μmol/ L 和100 μmol/L 的銀杏內(nèi)酯B 可顯著抑制SW480細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡。

本研究中，與模型組比較，紫杉醇組及銀杏內(nèi)酯B低、高劑量組細(xì)胞ROS、XIAP mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，與已有文獻(xiàn)結(jié)論一致［13］。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析認(rèn)為，XIAP 是基于序列互補(bǔ)的ROS 可能的靶標(biāo)［14］。ROS 在各種癌癥中異常表達(dá)，并促進(jìn)了乳腺癌、前列腺癌、肺癌的發(fā)生與發(fā)展，溴結(jié)構(gòu)域和植物同源結(jié)構(gòu)域的手指轉(zhuǎn)錄因子可作為核因子κB（NF - κB）途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并增強(qiáng)肺癌細(xì)胞中ROS 的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致預(yù)后不良［15］。另一項(xiàng)關(guān)于三陰性乳腺癌的研究表明，ROS表達(dá)上調(diào)是因?yàn)橹z粒蛋白U（有絲分裂必要的著絲粒成分）抑制了泛素化和蛋白酶體降解，此外，間質(zhì)相互作用分子1（STIM1）可能通過(guò)增強(qiáng)ROS的表達(dá)和升高前列腺素E2的水平來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移，而短發(fā)夾RNA 消耗STIM1 則抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移［16］。XIAP是位于ROS啟動(dòng)子區(qū)域的反義蛋白，XIAP 被認(rèn)為是通過(guò)隔離其抑制劑，p50 同源二聚體和螯合劑來(lái)激活NF - κB 信 號(hào) 傳導(dǎo)。這又 將NF - κB 亞基p65 募集到XIAP 啟動(dòng)子并增強(qiáng)了XIAP 轉(zhuǎn)錄。有研究表明，XIAP 與ROS mRNA 的表達(dá)高度相關(guān)，而XIAP 的異常表達(dá)可調(diào)節(jié)人巨噬細(xì)胞對(duì)脂多糖刺激及惡性造血的分化，XIAP 也可通過(guò)前列腺素的生物合成促進(jìn)腫瘤發(fā)生［17］，其在人肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并多與預(yù)后不良相關(guān)［18］。臨床研究表明，miR - 451 抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，其上調(diào)抑制了XIAP 表達(dá)，并且XIAP 還可激活Wnt 通路。同時(shí)，轉(zhuǎn)錄共激活子YAP 可通過(guò)與XIAP 啟動(dòng)子中的TEAD 結(jié)合位點(diǎn)相互作用，增強(qiáng)XIAP mRNA的表達(dá)，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥性［19-20］。

A.模型組 B.紫杉醇組 C.銀杏內(nèi)酯B低劑量組 D.銀杏內(nèi)酯B高劑量組圖1 流式細(xì)胞圖A.Model group B.Paclitaxel group C.Ginkgolide B low-dose group D.Ginkgolide B high-dose groupFig.1 Flow cytometry

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B 可有效抑制SW480 細(xì)胞的遷移和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制ROS/XIAP信號(hào)通路的激活有關(guān)。