何猛超，任義平，熊 林，謝三款，張嬌嬌，胡景輝，韓興林*

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.國(guó)家酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，北京 100015；3.貴州無(wú)憂酒業(yè)（集團(tuán)）有限公司，貴州 仁懷 564501）

中國(guó)白酒作為世界上著名的六大蒸餾酒之一，因其悠久的歷史、獨(dú)特的風(fēng)格特征和豐富的文化內(nèi)涵而深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。中國(guó)白酒包含不同的種類或品系，如醬香型白酒、濃香型白酒、清香型白酒等十二大香型白酒[3-5]。其中，醬香型白酒是現(xiàn)存白酒釀造工藝最為復(fù)雜，也是風(fēng)味最為豐富的一種香型，具有“四高兩長(zhǎng)”的工藝特點(diǎn)，即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫流酒以及生產(chǎn)周期長(zhǎng)、貯藏時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)[6]。高溫大曲的制備是其品質(zhì)和風(fēng)格形成的關(guān)鍵工藝之一[7-8]。

高溫大曲因其制曲過(guò)程中環(huán)境因素的空間差異形成了不同特征的大曲。在堆放過(guò)程中，不同的空間位置（如曲房中堆放的位置、堆放的內(nèi)層和外層）局部環(huán)境（如溫度、水分、氧濃度等）存在差異，從而形成不同特征的成品曲，且在顏色上差異明顯[9]。如果發(fā)酵前期溫度適宜，發(fā)酵后期干燥充分，會(huì)出現(xiàn)黃色大曲；發(fā)酵前期溫度過(guò)低，發(fā)酵后期干燥差，會(huì)出現(xiàn)白色大曲；在發(fā)酵前期由于升溫較快且后期干燥不充分會(huì)導(dǎo)致大曲發(fā)黑，出現(xiàn)黑色大曲[10]。生產(chǎn)中常通過(guò)經(jīng)驗(yàn)將上述不同顏色的曲搭配使用，以最佳配比使高溫大曲在整體上達(dá)到優(yōu)質(zhì)曲的生產(chǎn)效果。

高溫大曲作為醬香白酒重要的發(fā)酵劑和糖化劑，含有豐富的微生物和各種酶類，是醬香型白酒釀造過(guò)程中的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力[11-12]。其中以茅臺(tái)地區(qū)的高溫大曲最為典型，因?yàn)榈靥幊嗨庸鹊?，貴州高原最低點(diǎn)，年降水量800～900 mm，年無(wú)霜期326 d，持續(xù)高溫5個(gè)月（35～39 ℃），一年當(dāng)中長(zhǎng)達(dá)1 400 h的陽(yáng)光照射，長(zhǎng)期的高濕、高溫環(huán)境孕育了優(yōu)良的功能微生物，從而為釀造優(yōu)質(zhì)的醬香型白酒奠定了先天優(yōu)勢(shì)，這也是茅臺(tái)地區(qū)的白酒品質(zhì)保持穩(wěn)定性和獨(dú)特性的重要原因[13]。目前對(duì)于高溫大曲的研究多集中于解析高溫大曲的微生物構(gòu)成以及功能微生物的篩選和初步應(yīng)用[14]。如報(bào)道有高溫大曲中常見(jiàn)的細(xì)菌有芽孢桿菌、乳酸菌、醋酸菌等[15-16]；常見(jiàn)的真菌有釀酒酵母、假絲酵母、產(chǎn)酯酵母、米根霉、黑曲霉等[17-18]。此外，也有關(guān)于不同地區(qū)、不同廠家的高溫大曲在微生物的種類及豐度上存在差異研究[19-20]。然而，對(duì)于同一廠家同一批次的高溫大曲因局部環(huán)境差異引起的微生物分布差異，以及特征不同的高溫大曲搭配使用工藝等的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本研究采用理化分析結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同高溫大曲的理化特征和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在為醬香型白酒企業(yè)配曲工藝提供理論指導(dǎo)，促進(jìn)醬香型白酒智能化制曲應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

同批次的五種高溫大曲：普通曲、優(yōu)質(zhì)曲、白曲、黃曲、黑曲，每個(gè)樣品取樣量為1 kg粉碎后備用，其中優(yōu)質(zhì)曲、普通曲是根據(jù)長(zhǎng)期的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)積累進(jìn)行定義，優(yōu)質(zhì)曲的配比為黃曲（85%）、黑曲（10%）、白曲（5%），普通曲的配比為黃曲（30%）、黑曲（35%）、白曲（35%）。以上樣品均由貴州無(wú)憂酒業(yè)（集團(tuán)）有限公司提供。

1.1.2 化學(xué)試劑

無(wú)水乙醇、濃硫酸、氫氧化鈉、酚酞等（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯、己酸乙酯等標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；TAE緩沖液：北京索萊寶科技有限公司；引物：上海生物工程股份有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：日本Takara公司；瓊脂糖：南京生興生物技術(shù)有限公司；核酸染料Gengreen：上海賽百盛有限公司；土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）：美國(guó)Omega Bio-Tek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP1502電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；HH-S6A電熱恒溫水浴鍋：北京利偉永興儀器有限公司；PX2型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海賽默生物科技有限公司；DYY5穩(wěn)壓電泳儀：北京六一儀器廠；GeI Image System Tanon 1600凝膠成像儀：上海天能科技有限公司；ND-ONEC-U微量分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；AutoSystem XL氣相色譜儀、Clarns 600氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：珀金埃爾默（中國(guó)）股份有限公司；ICS-3000離子色譜儀：戴安（中國(guó)）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高溫大曲理化指標(biāo)的測(cè)定

不同類型高溫大曲的理化指標(biāo)（糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力、酸度等）依據(jù)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》測(cè)定[21]。

糖化力單位：在35 ℃、pH4.6條件下，1 g大曲1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)為一個(gè)單位（U），以“mg/（g·h）”表示。

液化力單位：在35 ℃、pH4.6條件下，1 g絕干曲1 h能液化淀粉的克數(shù)為一個(gè)單位（U），以“g/（g·h）”表示。

酯化力單位：每50g大曲在35℃，經(jīng)過(guò)7d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克數(shù)為一個(gè)單位（U），以“mg/（50 g·7 d）”表示。

發(fā)酵力單位：在30 ℃，72 h內(nèi)0.5 g大曲利用可發(fā)酵糖類所產(chǎn)生的二氧化碳克數(shù)為一個(gè)單位（U），以“g/（0.5 g·72 h）”表示。

1.3.2 大曲總DNA的提取及測(cè)序

（1）總DNA的提取[22-23]

稱取不同類型高溫大曲5 g用液氮速凍后迅速研磨。大曲總DNA提取方法按照土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）操作說(shuō)明書(shū)。為了保證所提取的基因組的濃度及純度對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物為338F/806R（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'/5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）；對(duì)真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1）進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為ITS5F/ITS1R（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'/5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。擴(kuò)增后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

（2）高通量測(cè)序

將檢測(cè)合格樣品送往天津諾和致源生物信息科技有限公司，通過(guò)高通量測(cè)序（Illumina Miseq PE250）平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，細(xì)菌使用SILVA138數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，真菌使用Unit（v8.2）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，以上均使用Nova Seq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序策略PE250。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品至少3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性差異以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)。典范對(duì)應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA）和冗余分析（redundancy analysis，RDA）采用CAVOCO 4.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同高溫大曲理化特征分析

理化指標(biāo)是評(píng)價(jià)高溫大曲品質(zhì)的重要依據(jù)[24-25]，對(duì)五種不同高溫大曲的糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力和酸度等理化指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同高溫大曲的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of different high-temperature Daqu

由表1可知，五種高溫大曲的糖化力在63.0～171.0 mg/（g·h）之間，其中優(yōu)質(zhì)曲的糖化力（171.0 mg/（g·h））最大，黑曲的糖化力（63.0 mg/（g·h））最小，糖化力大小的順序依次為優(yōu)質(zhì)曲＞白曲＞普通曲＞黃曲＞黑曲。五種高溫大曲的液化力范圍為0.13～0.27 g/（g·h），其中優(yōu)質(zhì)曲的液化力最高（0.27 g/（g·h）），黑曲的液化力最低（0.13 g/（g·h）），五種曲的液化力大小順序?yàn)閮?yōu)質(zhì)曲＞白曲＞普通曲＞黃曲＞黑曲，這與糖化力的大小順序一致。在酯化力指標(biāo)上，五種曲的酯化力范圍是78.26～160.19 mg/（50 g·7 d），其中白曲的酯化力（160.19 mg/（50 g·7 d））最大，黑曲的酯化力最?。?8.26 mg/（50 g·7 d）），五種曲的酯化力大小順序?yàn)榘浊緝?yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞普通曲＞黑曲。五種曲的發(fā)酵力大小處于0.01～0.43 g/（0.5 g·72 h）之間，其中黑曲的發(fā)酵力最大（0.43 g/（0.5 g·72 h）），白曲的發(fā)酵力最小（0.01 g/（0.5g·72h）），五種曲的發(fā)酵力大小順序?yàn)楹谇酒胀ㄇ緝?yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞白曲。五種曲的酸度范圍為1.5～1.9mmol/10g，其中黑曲的酸度（值為1.9 mmol/10 g）最大，普通曲的酸度（值為1.5mmol/10 g）最小，五種曲的酸度大小順序?yàn)楹谇景浊緝?yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞普通曲。

綜上，優(yōu)質(zhì)曲的糖化力和液化力數(shù)值均高于其他種類的曲，糖化力和液化力較高是其最大特點(diǎn)。白曲的發(fā)酵力在幾種曲中最低，遠(yuǎn)低于其他幾種高溫大曲，但白曲的酯化力最高，因此，白曲以發(fā)酵力弱、酯化力強(qiáng)為特點(diǎn)；而優(yōu)質(zhì)曲的發(fā)酵力處于中等水平、酯化力僅次于白曲。黃曲的糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力和酸度幾種理化指標(biāo)均處于五種曲形成的理化范圍之內(nèi)，與其他幾種曲相比各理化指標(biāo)適中。黑曲的發(fā)酵力數(shù)值均大于其他幾種曲，發(fā)酵力突出，且其糖化力、液化力、酯化力均是幾種曲中最低，具有發(fā)酵力高，糖化力、液化力、酯化力低的特點(diǎn)，此外，其酸度也高。

2.2 不同高溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 細(xì)菌群落多樣性分析

采用高通量測(cè)序（16S rRNA）技術(shù)對(duì)不同高溫大曲中的細(xì)菌進(jìn)行分析，α多樣性指數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，α指數(shù)多樣性分析顯示五種高溫大曲的Coverage均在99%以上，樣品的測(cè)序覆蓋率高，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)性反映樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)[26]。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示，五種高溫大曲的群落多樣性可分為三個(gè)等級(jí)，其中，優(yōu)質(zhì)曲、黃曲和白曲的兩種指數(shù)的數(shù)值較大，且這三種曲的兩指數(shù)數(shù)值相差不大；其次是普通曲，兩指數(shù)最小的是黑曲，因此，優(yōu)質(zhì)曲、黃曲和白曲的群落多樣性較高，其次是普通曲，群落多樣性最低的是黑曲。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)顯示，五種高溫大曲按照這兩種指數(shù)的數(shù)值大小進(jìn)行排序，體現(xiàn)群落豐富度的兩指數(shù)的大小順序一致，因此，五種高溫大曲的群落豐富度大小依次為：白曲＞優(yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞普通曲＞黑曲，其中黑曲的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)數(shù)值均遠(yuǎn)小于其他種類的曲。

表2 不同高溫大曲細(xì)菌α多樣性指數(shù)分析結(jié)果Table 2 Results of alpha diversity indexes of bacteria in different high-temperature Daqu

采用韋恩圖（圖1）對(duì)五種大曲的群落豐富度進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示，五種大曲中共檢測(cè)到2 238個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），不同高溫大曲中OTU的個(gè)數(shù)分別為：優(yōu)質(zhì)曲（1 275）、普通曲（1 164）、白曲（1 426）、黃曲（1 188）和黑曲（88）。其中，白曲的OTU個(gè)數(shù)最多，黑曲的OTU個(gè)數(shù)最少，這說(shuō)明白曲的群落豐富度最高，黑曲的群落豐富度最低，與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)分析得出的群落豐富度的結(jié)果一致。

圖1 不同大曲細(xì)菌OTU分析結(jié)果韋恩圖Fig.1 Venn diagram of bacterial OTU analysis results of different Daqu

2.2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

五種高溫大曲樣品中細(xì)菌的種類及相對(duì)豐度在屬水平上的分析結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在屬水平上，五種高溫大曲涉及的主要細(xì)菌（占比＞1%）有：UnidentifiedMitochondria、芽孢桿菌屬（Bacillus）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、Kroppenstedtia、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、醋桿菌屬（Acetobacter）等。

圖2 不同高溫大曲在屬水平上的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure of different high-temperature Daqu at genus level

在不同樣品中，細(xì)菌的種類、豐度等方面的菌群結(jié)構(gòu)特征不同[27]。不同高溫大曲屬水平主要細(xì)菌（占比＞1%）占比結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同高溫大曲屬水平主要細(xì)菌占比Table 3 Main bacteria proportion in different high temperature Daqu at genus level%

由表3可知，細(xì)菌群落豐富度大小依次為：白曲＞優(yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞普通曲＞黑曲，白曲豐富度最高，其次是黃曲，黑曲豐富度最低。UnidentifiedMitochondria、芽孢桿菌屬是優(yōu)質(zhì)曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群；UnidentifiedMitochondria、高溫放線菌屬是普通曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群；乳桿菌屬、高溫放線菌屬是白曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬；芽孢桿菌屬、大洋桿菌屬是黃曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬；UnidentifiedMitochondria是黑曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。根據(jù)不同顏色大曲在優(yōu)質(zhì)曲中的配比，黃曲是優(yōu)質(zhì)曲中的主體，優(yōu)質(zhì)曲的豐富度與黃曲接近，這與細(xì)菌群落豐富度分析結(jié)果一致。優(yōu)質(zhì)曲制備過(guò)程中，作為主體的黃曲中添加群落豐富度更高的白曲，使得優(yōu)質(zhì)曲的群落豐富度高于黃曲，介于黃曲和白曲之間。

2.3 不同高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 真菌群落多樣性分析

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同高溫大曲中的真菌進(jìn)行分析，真菌α多樣性指數(shù)分析結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，五種高溫大曲的Coverage均在100%，樣品的測(cè)序覆蓋率高，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)性反映樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示，五種高溫大曲的真菌群落多樣性也可分為三個(gè)等級(jí)，其中，優(yōu)質(zhì)曲的兩種指數(shù)的數(shù)值最大；其次是黃曲和黑曲，兩指數(shù)較小的是普通曲和白曲，因此，優(yōu)質(zhì)曲的群落多樣性最高，其次是黃曲和黑曲，群落多樣性較低的是普通曲和白曲?；贑hao1指數(shù)和Ace指數(shù)的五種高溫大曲群落豐富度的大小順序一致，依次為：白曲＞普通曲＞優(yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞黑曲。

表4 真菌α多樣性指數(shù)分析結(jié)果Table 4 Analysis results of alpha diversity indexes of fungus

采用不同大曲真菌OTU分析的韋恩圖（圖3）對(duì)五種大曲中真菌的群落豐富度進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示，五種大曲中真菌共檢測(cè)到139個(gè)OTU，不同高溫大曲中真菌OTU的個(gè)數(shù)分別為：優(yōu)質(zhì)曲（64）、普通曲（62）、白曲（87）、黃曲（41）和黑曲（35）。其中，白曲的OTU個(gè)數(shù)最多，黑曲的OTU個(gè)數(shù)最少，這說(shuō)明白曲的群落豐富度最高，黑曲的群落豐富度最低，與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)分析得出的群落豐富度的結(jié)果一致。

圖3 不同大曲真菌OTU分析結(jié)果韋恩圖Fig.3 Venn diagram of fungal OTU analysis of different Daqu

2.3.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

在不同高溫大曲樣品中，真菌的種類、豐度等方面的群落結(jié)構(gòu)不同[28]。不同高溫大曲在屬水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4，不同高溫大曲屬水平主要真菌（占比＞1%）的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

圖4 不同高溫大曲在屬水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Fungal structure of different high temperature Daqu at genus level

表5 不同高溫大曲屬水平主要真菌占比Table 5 Main fungus proportion of different high temperature Daqu at genus level%

屬水平上的真菌種類分布顯示，真菌群落豐富度大小依次為：白曲＞普通曲＞優(yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞黑曲，白曲、黃曲、黑曲和優(yōu)質(zhì)曲的豐富度特征與細(xì)菌群落一致，其中，熱子囊菌屬（Thermoascus）是優(yōu)質(zhì)曲、普通曲、白曲、黑曲的主要優(yōu)勢(shì)真菌群落結(jié)構(gòu)；而短梗蠕孢屬（Trichocladium）是黃曲的優(yōu)勢(shì)真菌群落結(jié)構(gòu)。因此，優(yōu)質(zhì)曲通過(guò)不同大曲的合理搭配，優(yōu)化了微生物群落多樣性。白曲、黃曲和黑曲在普通曲中的配比在30%～35%，比例接近，沒(méi)有顯示出突出特征，群落豐富度在白曲和黑曲之間波動(dòng)。

2.4 高溫大曲理化特征與微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)性分析

2.4.1 細(xì)菌與理化特征典范對(duì)應(yīng)分析

采用CCA方法分析不同高溫大曲的理化特征與細(xì)菌之間的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，五種高溫大曲較為分散，相互之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可能差異較大。對(duì)樣品與理化之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析表明，酯化力、糖化力和液化力三者可能對(duì)白曲和優(yōu)質(zhì)曲的影響最大，發(fā)酵力和酸度可能對(duì)黑曲的影響最大，而普通曲和黃曲可能受各項(xiàng)理化特征的影響不突出，以上分析與表1中對(duì)理化特征分析具有一致性。樣品與微生物之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系分析顯示，可能對(duì)普通曲和黃曲產(chǎn)生較大影響的細(xì)菌排序依次為大洋芽孢桿菌屬＞Kroppenstedtia＞芽孢桿菌屬＞醋桿菌屬，可能對(duì)優(yōu)質(zhì)曲和白曲產(chǎn)生較大影響的細(xì)菌排序依次為鏈球菌屬＞熱放線菌屬＞乳桿菌屬＞魏斯氏菌屬＞片球菌屬，而可能對(duì)黑曲產(chǎn)生較大影響的細(xì)菌為立克次氏體。這些可能對(duì)各種曲產(chǎn)生較大影響的細(xì)菌大多為對(duì)應(yīng)曲種的優(yōu)勢(shì)菌群。因此，樣品與理化特征、細(xì)菌之間的對(duì)應(yīng)分析顯示該方法能夠準(zhǔn)確反映大曲的理化特征和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析理化特征與微生物之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，結(jié)果顯示，可能對(duì)酯化力、糖化力和液化力產(chǎn)生較大影響的細(xì)菌排序依次為鏈球菌屬＞熱放線菌屬＞乳桿菌屬＞魏斯氏菌屬＞片球菌屬，可能對(duì)發(fā)酵力和酸度產(chǎn)生較大影響的細(xì)菌為立克次氏體，而大洋芽孢桿菌、Kroppenstedtia、芽孢桿菌屬和醋桿菌屬與幾種理化特征的相關(guān)性不大。

圖5 典范對(duì)應(yīng)分析結(jié)果Fig.5 Results of canonical correspondence analysis

2.4.2 真菌與理化特征冗余分析

采用RDA的方法分析理化特征與真菌之間的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，五種高溫大曲中，優(yōu)質(zhì)曲、白曲和黑曲三者在真菌群落結(jié)構(gòu)上較為相近，普通曲和黃曲真菌的群落結(jié)構(gòu)與其他幾種曲相差較大。對(duì)樣品與理化指標(biāo)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，理化指標(biāo)中與普通曲相關(guān)性較大的是發(fā)酵力，其他理化指標(biāo)與普通曲的相關(guān)性不明顯。黃曲與各理化特征的相關(guān)性均不明顯。理化指標(biāo)與優(yōu)質(zhì)曲、白曲和黑曲的相關(guān)性較為一致，相關(guān)性大小排序依次為酸度＞酯化力＞糖化力＞液化力＞發(fā)酵力。對(duì)樣品與微生物之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，酯化力、糖化力和液化力三者可能對(duì)白曲和優(yōu)質(zhì)曲的影響最大，發(fā)酵力和酸度可能對(duì)黑曲的影響最大，而普通曲和黃曲可能受各項(xiàng)理化特征的影響不突出，以上分析與表1中對(duì)理化特征分析具有一致性。RDA結(jié)果（圖6）表明，熱子囊菌屬與優(yōu)質(zhì)曲的糖化力、液化力和酯化力相關(guān)性較強(qiáng)，且該屬是優(yōu)質(zhì)曲的優(yōu)勢(shì)菌群，因此，該屬對(duì)優(yōu)質(zhì)曲的糖化力、液化力和酯化力產(chǎn)生重要影響。同樣地，該屬也是白曲和黑曲的優(yōu)勢(shì)菌群且與三種曲相關(guān)性較強(qiáng)，對(duì)白曲、黑曲的糖化力、液化力和酯化力均產(chǎn)生重要影響，如熱子囊菌屬可能是形成糖化力、液化力和酯化力等理化特征的關(guān)鍵功能微生物，這將有利于后期功能微生物的分離篩選和應(yīng)用。

圖6 冗余分析結(jié)果Fig.6 Results of redundancy analysis

2.5 討論

在以經(jīng)驗(yàn)為指導(dǎo)的生產(chǎn)中，品質(zhì)較好的醬香型白酒常將不同大曲（白曲、黃曲和黑曲）進(jìn)行適當(dāng)搭配，配制呈適合高品質(zhì)醬香型白酒釀造的優(yōu)質(zhì)曲。通過(guò)群落結(jié)構(gòu)中多樣性分析顯示，細(xì)菌群落豐富度大小依次為：白曲＞優(yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞普通曲＞黑曲；真菌群落豐富度大小依次為：白曲＞普通曲＞優(yōu)質(zhì)曲＞黃曲＞黑曲，可以看出白曲、黃曲、黑曲和優(yōu)質(zhì)曲的豐富度特征與細(xì)菌、真菌群落是一致的。因此，優(yōu)質(zhì)曲通過(guò)不同大曲的合理搭配，優(yōu)化了微生物群落多樣性。白曲、黃曲和黑曲在普通曲中的配比在30%～35%，比例接近，沒(méi)有顯示出突出特征，群落豐富度在白曲和黑曲之間波動(dòng)。

進(jìn)一步地，對(duì)構(gòu)成群落多樣性的微生物種類和豐度進(jìn)行剖析，根據(jù)不同大曲中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析，優(yōu)質(zhì)曲的三種優(yōu)勢(shì)菌群分別是黃曲、白曲和黑曲中的優(yōu)勢(shì)菌群，因此，搭配工藝使黃曲、白曲和黑曲中的其中三種細(xì)菌構(gòu)成優(yōu)質(zhì)曲的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群，并和各曲的其他細(xì)菌構(gòu)成優(yōu)質(zhì)曲特殊的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；真菌的群落結(jié)構(gòu)分析顯示，通過(guò)向黃曲中添加白曲和黑曲，使得形成的優(yōu)質(zhì)曲中熱子囊菌屬的占比相對(duì)于主體黃曲大幅提高，而普通曲以UnidentifiedMitochondria、熱放線菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，以熱子囊菌屬為優(yōu)勢(shì)真菌，與白曲、黃曲和黑曲的優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)比觀察可得，普通曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和優(yōu)勢(shì)真菌多數(shù)包含在白曲、黃曲和黑曲組成的優(yōu)勢(shì)菌群集合之內(nèi)，不具有與某一顏色大曲突出相似的特征。

理化特征分析顯示，優(yōu)質(zhì)曲以糖化力和液化力較高為特征。是因?yàn)辄S曲中添加糖化力、液化力和酯化力最強(qiáng)的白曲，使得優(yōu)質(zhì)曲的糖化力和液化力突出，酯化力提高到僅次于白曲。黃曲中添加發(fā)酵力最強(qiáng)的黑曲，提高了優(yōu)質(zhì)曲的發(fā)酵力。關(guān)聯(lián)性分析顯示出影響各大曲理化特征的潛在功能微生物，CCA結(jié)果顯示了大曲的理化特征與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，鏈球菌屬、熱放線菌屬等可能對(duì)大曲酯化力、糖化力和液化力產(chǎn)生較大影響，UnidentifiedMitochondria則對(duì)大曲的發(fā)酵力和酸度產(chǎn)生影響較大，而大洋芽孢桿菌、Kroppenstedtia、芽孢桿菌屬和醋桿菌屬與幾種理化特征的相關(guān)性不大；RDA分析顯示熱子囊菌屬與優(yōu)質(zhì)曲的糖化力、液化力和酯化力相關(guān)性較強(qiáng)，且該屬是優(yōu)質(zhì)曲的優(yōu)勢(shì)菌群，因此，該屬對(duì)優(yōu)質(zhì)曲的糖化力、液化力和酯化力產(chǎn)生重要影響。同樣地，該屬也是白曲和黑曲的優(yōu)勢(shì)菌群且與三種曲相關(guān)性較強(qiáng)，因此，對(duì)白曲、黑曲的糖化力、液化力和酯化力產(chǎn)生重要影響。熱子囊菌屬也是黃曲的優(yōu)勢(shì)菌群，但相對(duì)白曲和黑曲相對(duì)豐度較低，因此，黃曲中加入熱子囊菌屬相對(duì)豐度較高的白曲和黑曲，提高了優(yōu)質(zhì)曲中的該屬的相對(duì)豐度，形成了優(yōu)質(zhì)曲的優(yōu)勢(shì)菌群和理化特征。這樣，優(yōu)質(zhì)曲通過(guò)不同顏色的大曲合理搭配，將影響各自理化特征的優(yōu)勢(shì)菌群富集在一起，形成優(yōu)質(zhì)曲獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)菌群和群落結(jié)構(gòu)，最終提高其理化特征。此外，通過(guò)關(guān)聯(lián)性分析，揭示了影響各大曲理化特征的潛在功能微生物。

因此，樣品與理化特征、細(xì)菌之間的對(duì)應(yīng)分析顯示該方法能夠準(zhǔn)確反映大曲的理化特征和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析理化特征與微生物之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，結(jié)果顯示，可能對(duì)酯化力、糖化力和液化力產(chǎn)生較大影響的細(xì)菌排序依次為鏈球菌屬＞熱放線菌屬＞乳桿菌屬＞魏斯氏菌屬＞片球菌屬，可能對(duì)發(fā)酵力和酸度產(chǎn)生較大影響的細(xì)菌為立克次氏體，而大洋芽孢桿菌、Kroppenstedtia、芽孢桿菌屬和醋桿菌屬與幾種理化特征的相關(guān)性不大。

3 結(jié)論

白曲、黃曲和黑曲的合理搭配提高了優(yōu)質(zhì)曲中微生物的群落多樣性，以及優(yōu)化了高溫大曲整體的理化特性。具體地，不同顏色大曲的最佳配比形成了以芽孢桿菌屬（Bacillus）、熱放線菌屬（Thermoactinomyces）、UnidentifiedMitochondria和熱子囊菌屬（Thermoascus）為優(yōu)勢(shì)菌群的特殊的群落結(jié)構(gòu)，以糖化力、液化力突出，酯化力較高，發(fā)酵力適中的優(yōu)質(zhì)高溫大曲。優(yōu)質(zhì)曲和普通曲的群落結(jié)構(gòu)特征和理化特征分析顯示，不同顏色大曲的配比對(duì)形成新產(chǎn)品大曲的群落結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)至關(guān)重要。