劉媛潔，張 良

（1.江西醫(yī)學高等?？茖W校 臨床醫(yī)學院，江西 上饒 334099；2.江西省食品發(fā)酵研究所，江西 宜春 336023）

青錢柳（Cyclocarya paliurus）又名搖錢樹，是中國特有、國家二級保護的珍惜樹種，廣泛分布于浙江、江西、湖北和湖南等地[1-2]。青錢柳葉中含有黃酮、多糖、三萜、有機酸類等多種天然功能性活性物質[3-4]，在降血糖、降血壓、降血脂、抗氧化等方面具有一定的功效[5-7]?；谇噱X柳葉的藥食兼用的價值，青錢柳葉茶已通過美國食品藥品管理局的認證，青錢柳葉已列入中國新資源食品原料目錄[8-9]。青錢柳干燥葉片中多糖含量范圍為0.93%～5.36%[10-11]，青錢柳多糖是青錢柳葉中主要的活性物質之一，也是目前研究較多的青錢柳活性物質[12-14]。謝建華等[15]利用熱水浸提法提取青錢柳多糖，其提取率為6.54%。李彥坡等[1]利用超聲波輔助微波提取法提取青錢柳多糖，提取率為10.02%。胡文兵等[16]利用超聲波輔助復合酶（纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶）法提取青錢柳多糖，其提取率為7.18%。魯青等[17]采用微生物發(fā)酵法（黑曲霉（Aspergillus oryzae）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis））同步提取青錢柳多糖，其提取率為7.57%，較優(yōu)化前增加50.50%。

酶菌協(xié)同發(fā)酵是指原料經酶解工藝后，再經微生物菌種發(fā)酵的過程[18]。酶解是利用纖維素酶和半纖維素酶的高效專一性破壞分解植物細胞等組織結構，提高目標天然活性物質的溶出量[19]，但不能解決青錢柳特有的苦澀味問題[17]。微生物發(fā)酵是通過菌種生長過程中產生各種酶系提高目標天然活性物質的溶出量[20]，此外，益生菌等菌種發(fā)酵不僅會產生功能性代謝產物和風味物質，也可以去除青錢柳的苦澀味[21]，但存在發(fā)酵酶系活力和酶量不足的問題。

本研究以產自江西九江修水縣的青錢柳葉為原料，選用纖維素酶和半纖維素酶對青錢柳葉進行酶解，以高產纖維素酶的粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為發(fā)酵菌種對其酶解液進行發(fā)酵，以青錢柳多糖的含量為評價指標，通過單因素試驗及響應面試驗對酶菌協(xié)同發(fā)酵產青錢柳多糖的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。以期獲得青錢柳多糖含量較高、適口性好的發(fā)酵型青錢柳飲品，為青錢柳葉的精深加工和高值化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

青錢柳葉：產自江西九江市修水縣；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：由江西省食品發(fā)酵研究所菌種保藏中心提供。

1.1.2 試劑

半纖維素酶（酶活100 000 U/g）、纖維素酶（酶活20 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；硫酸、苯酚（均為分析純）：天津金匯太亞化學試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：默克化工技術（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

T6紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：南通三思機電有限公司；FA1204電子天平：上海精科天美有限公司；YDJ-200B恒溫搖床：英檢達儀器（重慶）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液的制備

挑取4環(huán)斜面保藏的粗糙脈孢菌接種到裝液量為80 mL/250 mL的PDB培養(yǎng)基中，搖床（30 ℃，140 r/min）培養(yǎng)24 h，制備粗糙脈孢菌種子液；挑取4環(huán)斜面枯草芽孢桿菌接到裝液量為80 mL/250 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，搖床（35 ℃，140 r/min）培養(yǎng)18 h，得到枯草芽孢桿菌種子液。

1.3.2 青錢柳多糖的制備

取干燥粉碎后過20目篩的青錢柳葉，設置裝料量為6.0 g/250 mL，按照料液比6∶100（g∶mL），加入蒸餾水后搖勻。按照青錢柳葉細粉質量的0.6%添加復合酶（纖維素酶和半纖維素酶質量比為1∶1），在55 ℃下恒溫水浴酶解3.0 h后，在100 ℃下滅酶活20 min。按照酶解液后原料總質量的8%添加蔗糖，經121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻，按照酶解液原料總質量的4%接種混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質量比為1∶1）種子液，置于恒溫搖床（32℃，140 r/min）培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液在5 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min后，取上清液，檢測發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量。

1.3.3 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

按照1.3.2的工藝條件，固定單因素試驗條件為：料液比6∶100（g∶mL）、復合酶（纖維素酶和半纖維素酶）質量比1∶1、復合酶添加量0.6%、酶解時間3.0 h、蔗糖添加量8%、混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌）質量比1∶1、混合菌接種量4%、發(fā)酵時間48 h。

以青錢柳多糖含量為評價指標，分別考察料液比（2∶100、4∶100、6∶100、8∶100、10∶100、12∶100（g∶mL））、纖維素酶和半纖維素酶質量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、復合酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、酶解時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、蔗糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、粗糙脈孢菌與枯草芽孢桿菌質量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、混合菌接種量（2%、3%、4%、5%、6%）和發(fā)酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）對青錢柳多糖含量的影響。

1.3.4 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

（1）Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗基礎上，以青錢柳多糖含量為響應值，選取8個影響因素料液比（X1）、復合酶添加量（X2）、纖維素酶和半纖維素酶質量比（X3）、酶解時間（X4）、蔗糖添加量（X5）、混合菌添加量（X6）、混合菌質量比（X7）、發(fā)酵時間（X8），對8個因素的最優(yōu)發(fā)酵條件范圍分別取高、低兩個水平，運用Plackett-Burman試驗設計篩選對發(fā)酵液中青錢柳多糖含量影響顯著的因素。Plackett-Burman試驗設計因素及水平見表1。

表1 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbe

（2）Box-Behnken試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，以發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量（Y）為響應值，選擇對結果顯著性影響的因素纖維素酶和半纖維素酶質量比（A）、蔗糖添加量（B）和混合菌添加量（C）為自變量，進行Box-Behnken試驗優(yōu)化，Box-Behnken試驗因素及水平見表2。

表2 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設計因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbe

1.3.5 青錢柳多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[22]測定多糖含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8.0.6軟件進行Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設計，采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結果

2.1.1 料液比對青錢柳多糖含量的影響

料液比對青錢柳多糖含量的影響見圖1。由圖1可知，隨著料液比在2∶100～8∶100（g∶mL）范圍內的逐漸增加，發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量呈增加的趨勢；當料液比為8∶100（g∶mL）時，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量達到最高值，為2.46 mg/mL；當料液比為8∶100～12∶100（g∶mL）時，青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，料液比太小不利于青錢柳的充分發(fā)酵，而隨著料液比的增加，有利于多糖從組織細胞內溶出到周圍溶液中，但過大的料液比也會造成有效成分損失，青錢柳葉干燥粉濃度相對降低進而導致青錢柳多糖含量的減少[23]。因此，選擇最適的料液比為8∶100（g∶mL）。

圖1 料液比對青錢柳多糖含量的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

2.1.2 復合酶添加量對青錢柳多糖含量的影響

復合酶添加量對青錢柳多糖含量的影響見圖2。由圖2可知，隨著復合酶添加量在0.2%～0.8%范圍內的增加，發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢；當復合酶添加量為0.8%時，發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量達最大值，為2.43 mg/mL；當復合酶添加量＞0.8%之后，青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，復合酶添加量低時酶解不充分，青錢柳多糖和其他活性物質等溶出較少，發(fā)酵液中營養(yǎng)元素不是發(fā)酵菌的最佳生長條件，導致發(fā)酵液中青錢柳多糖含量較少；隨著復合酶添加量的增加，酶解效果較好，青錢柳多糖和其他活性物質等溶出較高，但發(fā)酵菌生長較快，多糖等營養(yǎng)物質消耗也較快，導致發(fā)酵液中青錢柳多糖含量緩慢下降[24]。因此，選擇最適復合酶（纖維素酶與半纖維素酶）添加量為0.8%。

圖2 復合酶添加量對青錢柳多糖含量的影響Fig.2 Effect of compound enzyme addition on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

2.1.3 復合酶質量比對青錢柳多糖含量的影響

纖維素酶和半纖維素酶質量比對青錢柳多糖含量的影響見圖3。由圖3可知，隨著復合酶（纖維素酶與半纖維素酶）質量比在1∶3、1∶2、1∶1、2∶1的變化，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量呈上升趨勢；當復合酶質量比為2∶1時，青錢柳多糖含量達最大值，為2.35 mg/mL；當復合酶質量比高于2∶1時，青錢柳多糖含量略有下降。分析原因可能是隨著纖維素酶質量占比的增加，酶解出的青錢柳多糖含量等營養(yǎng)活性物質逐漸增加，發(fā)酵菌在較低的纖維素酶質量占比時，生長較慢，水解出的青錢柳多糖較少，但纖維素酶質量占比較高時，發(fā)酵菌生長較快，消耗青錢柳多糖等營養(yǎng)物質較快，青錢柳多糖含量略有降低[25]。因此，選擇最適纖維素酶與半纖維素酶質量比為2∶1。

圖3 纖維素酶和半纖維素酶質量比對青錢柳多糖含量的影響Fig.3 Effect of cellulase and hemi cellulase mass ratio on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus

2.1.4 酶解時間對青錢柳多糖含量的影響

酶解時間對青錢柳多糖含量的影響見圖4。由圖4可知，隨著酶解時間在1.0～2.5 h范圍內的增加，發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量呈現(xiàn)增加的趨勢；當酶解時間為2.5 h時，青錢柳多糖含量達最大值，為2.26 mg/mL。酶解時間＞2.5 h之后，青錢柳多糖含量下降。其原因可能是，青錢柳多糖會受酶解作用的影響發(fā)生部分水解，導致青錢柳多糖含量降低[26]。因此，選擇最適酶解時間為2.5 h。

圖4 酶解時間對青錢柳多糖含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

2.1.5 蔗糖添加量對青錢柳多糖含量的影響

蔗糖添加量對青錢柳多糖含量的影響見圖5。由圖5可知，隨著蔗糖添加量在4%～8%范圍內的增加，發(fā)酵液中青錢柳多糖的含量呈先增加的趨勢；當蔗糖添加量為8%時，青錢柳多糖含量達最大值，為2.22 mg/mL；當蔗糖添加量＞8%之后，青錢柳多糖含量下降。分析原因可能是，作為培養(yǎng)基的蔗糖濃度過高，發(fā)酵菌種細胞的滲透壓過大，菌體生長緩慢，導致青錢柳多糖含量降低[27]。因此，選擇最適的蔗糖添加量為8%。

圖5 蔗糖添加量對青錢柳多糖含量的影響Fig.5 Effect of sucrose addition on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

2.1.6 混合菌添加量對青錢柳多糖含量的影響

混合菌添加量對青錢柳多糖含量的影響見圖6。由圖6可知，隨著混合菌添加量在2%～4%范圍內的增加，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量增加；當混合菌添加量為4%時，青錢柳多糖含量達最大值，為2.22 mg/mL；當混合菌添加量＞4%之后，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量下降。分析原因可能是，混合菌添加量過高，會使培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質不能滿足發(fā)酵菌種的生長，同時消耗培養(yǎng)基中的多糖等活性物質滿足菌種的生長，導致發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量降低[28]。因此，選擇最適的混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌）添加量為4%。

圖6 混合菌添加量對青錢柳多糖含量的影響Fig.6 Effect of mixed microbes addition on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

2.1.7 混合菌質量比對青錢柳多糖含量的影響

混合菌質量比對青錢柳多糖含量的影響見圖7。由圖7可知，隨混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌）質量比在1∶3、1∶2、1∶1、2∶1范圍內的變化，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢；當混合菌質量比為2∶1時，發(fā)酵液中

圖7 粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質量比對青錢柳多糖含量的影響Fig.7 Effect of Neurospora crassa and Bacillus subtilis mass ratio on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

青錢柳多糖含量達到最高值（2.36 mg/mL）；當混合菌質量比＞2∶1時，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量下降。究其原因可能是，粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌在生長過程中，會分泌大量有利于粗纖維和木質素降解的纖維素酶系和其他水解酶，有利于細胞組織結構中多糖的釋放到發(fā)酵液中[29]?；旌暇|量比的不同，菌種自身生長和代謝所需要的營養(yǎng)物質不一樣，菌種間相互生長和代謝的制約程度不一樣[30]。因此，選擇最適的混合菌（粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌）質量比為2∶1。

2.1.8 發(fā)酵時間對青錢柳多糖含量的影響

發(fā)酵時間對青錢柳多糖含量的影響見圖8。由圖8可知，隨著發(fā)酵時間在24～60 h范圍內的延長，青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增加的趨勢；當發(fā)酵時間為60 h時，青錢柳多糖含量達最大值，為2.56 mg/mL；發(fā)酵時間＞60 h后，發(fā)酵液中的青錢柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，發(fā)酵菌種進入生長的衰老期，分泌的酶量不再增加，同時發(fā)酵菌產生了能降解青錢柳多糖的酶，使青錢柳多糖含量逐漸減低[31]。因此，選擇最適的發(fā)酵時間為60 h。

圖8 發(fā)酵時間對青錢柳多糖含量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus

2.2 青錢柳多糖的酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗結果

（1）Plackett-Burman試驗結果

在單因素試驗基礎上，以青錢柳多糖含量（Y）為響應值，選取8個因素料液比（X1）、復合酶添加量（X2）、纖維素酶和半纖維素酶質量比（X3）、酶解時間（X4）、蔗糖添加量（X5）、混合菌添加量（X6）、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質量比（X7）、發(fā)酵時間（X8），按照Plackett-Burman試驗設計，在不同發(fā)酵條件下進行試驗，結果見表3，運用Design-Expert 8.0.6對表3的數(shù)據(jù)進行處理，結果見表4。

表3 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗設計結果與分析Table 3 Results and analysis of Plackett-Burman tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbes

由表4可知，模型的P值為0.015 1，表示該模型顯著（P＜0.05）；模型的決定系數(shù)R2=0.982 2，調整決定系數(shù)R2Adj=0.934 7，說明存在93.47%的試驗數(shù)據(jù)可用該模型解釋。從各因素的P值可以看出，纖維素酶和半纖維素酶質量比（X3）對發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響極顯著（P＜0.01），蔗糖添加量（X5）和混合菌添加量（X6）對發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響顯著（P＜0.05）。因此，選擇纖維素酶和半纖維素酶質量比、蔗糖添加量和混合菌添加量3個因素進行Box-Behnken試驗設計。

表4 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman tests results

（2）Box-Behnken試驗結果

在上述試驗的基礎上，固定不顯著影響因素分別為料液比8∶100（g∶mL）、復合酶添加量0.8%、酶解時間2.5 h、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質量比2∶1、發(fā)酵時間60 h。以青錢柳多糖含量（Y）為響應值，以纖維素酶和半纖維素酶質量比（A）、蔗糖添加量（B）和混合菌添加量（C）3個因素進行Box-Behnken試驗設計。Box-Behnken試驗設計及結果見表5，方差分析結果見表6。

表5 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Design and results of Box-Behnken tests for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbes

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表5數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，經多元回歸擬合，得到模型的二次多項式方程為：

由表6可知，該模型P＜0.000 1，表明建立的模型極顯著（P＜0.01）；失擬項P值=0.401 2，不顯著（P＞0.05），表明建立的模型擬合度較好[32]；模型的決定系數(shù)R2為0.988 1，調整決定系數(shù)R2Adj為0.972 9，表明97.29%的響應值變化能由該模型進行解釋，實際試驗與模型建立的方程擬合度較好，能用于分析和預測發(fā)酵液中青錢柳多糖的工藝優(yōu)化。由P值可知，一次項A、C，交互項AB、BC，二次項A2、B2和C2對發(fā)酵液中青錢柳多糖含量的影響極顯著（P＜0.01），其他因素均不顯著（P＞0.05）。模型的F值越大對青錢柳多糖含量的影響越大[33]。由F值可知，各因素對酶菌協(xié)同發(fā)酵青錢柳多糖含量的影響程度為：C（混合菌添加量）＞A（纖維素酶和半纖維素酶質量比）＞B（蔗糖添加量）。

各因素交互作用對酶菌協(xié)同發(fā)酵產青錢柳多糖影響的響應面及等高線見圖9。

圖9 各因素間交互作用對酶菌協(xié)同發(fā)酵產青錢柳多糖含量影響的響應面及等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the contents of polysaccharide from Cyclocarya paliurus

自變量因素對響應值的影響與響應面坡度陡峭程度呈正相關[34]；等高線呈橢圓形的程度與兩個自變量交互作用的程度呈正相關[35]。由圖9可知，AB和BC的交互作用對響應值的影響較大，隨著各因素數(shù)值的增大，青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，響應面呈凸型陡峭曲面，對應的等高線呈橢圓形，表明AB和BC的交互作用顯著（P＜0.05），青錢柳多糖含量存在極大值；而AC有交互作用，但不顯著（P＞0.05），這與方差分析結果一致。

2.3 驗證試驗

根據(jù)模型的回歸方程分析，獲得最佳的酶菌協(xié)同發(fā)酵產青錢柳多糖工藝條件為：纖維素酶和半纖維素酶質量比1.8∶1.0、蔗糖添加量8.33%、混合菌添加量4.91%。在此最佳條件下，青錢柳多糖含量理論值可達3.35 mg/mL。考慮具體試驗的可操作性，修正最佳工藝條件為：復合酶添加量0.8%、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.0%。在此優(yōu)化條件下，青錢柳多糖含量的實際值為3.34 mg/mL，與預測值的相對誤差為0.30%，說明該模型準確度良好。

3 結論

以發(fā)酵液中青錢柳多糖含量為響應值，采用單因素試驗結合響應面試驗優(yōu)化酶菌協(xié)同發(fā)酵產青錢柳多糖的工藝條件。最終確定最佳工藝條件為：料液比8∶100（mg∶mL）、復合酶添加量0.8%、纖維素酶和半纖維素酶質量比1.8∶1.0、酶解時間2.5 h、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.0%、粗糙脈孢菌和枯草芽孢桿菌質量比2∶1、發(fā)酵時間60 h。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中青錢柳多糖含量為3.34 mg/L。該方法結合了酶解法和微生物發(fā)酵法，酶菌協(xié)同發(fā)酵克服了單一酶解時青錢柳有苦澀味問題和單一微生物發(fā)酵酶系不足等問題，顯著提高了青錢柳多糖的含量，可為青錢柳精深加工提供物質基礎，為青錢柳的高效利用開創(chuàng)了新的途徑，對制備適口性強和高含量青錢柳多糖的產品有一定的產業(yè)化意義。