連希希，孫佳寧，孫伶俐，劉 佳，王聯(lián)芝，段正超

（湖北民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000）

香菇作為一種藥食兩用菌有著廣泛的用途。在藥用方面，香菇中含有豐富的活性成分，在抗腫瘤、護(hù)肝、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫力等方面有很好的功效[1-3]，因此人們對香菇在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著較深入的研究。在食用方面，香菇因其具有特殊的風(fēng)味，深受人們的喜歡。鮮香菇高溫加工制作成干香菇時，碳水化合物經(jīng)過熱降解、美拉德反應(yīng)等化學(xué)變化從而產(chǎn)生香氣[4]，遺傳、生長環(huán)境等多種因素亦會影響香菇的香氣[5]。香菇的揮發(fā)性成分中，香味閾值以上的揮發(fā)性成分對風(fēng)味起關(guān)鍵作用[6]。

香菇揮發(fā)性成分的萃取方法主要可分為兩大類：溶劑萃取法和頂空萃取法。LIAO P H等[7]利用同時蒸餾萃取法（simultaneous distillation extraction，SDE）提取啤酒中的酯類化合物，發(fā)現(xiàn)該方法對設(shè)備要求簡單，成本較低，但對蒸氣壓低的組分萃取不完全；MILLER K G等[8]在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）無溶劑殘留，但是實驗過程中萃取物很容易將管路堵塞；FRANCHINA F A等[9]利用動態(tài)頂空吹掃-捕集技術(shù)對不同風(fēng)味的啤酒進(jìn)行鑒定，此方法可以減少熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分解，但操作繁瑣、成本高；PAIVA A C等[10]綜述了頂空固相微萃取（head space solid phase micro-extraction，SPME）對環(huán)境、食品、生物等樣品的萃取，操作方便、重復(fù)性好、檢測限可達(dá)到ng/g～pg/g級別，但分析結(jié)果受吸附頭的影響較大。頂空固相微萃取（HS-SPME）是一種集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，操作簡單、克服了固相萃取吸附劑孔道易堵塞缺點的萃取方法[11]。煎煮法和水蒸氣蒸餾法對設(shè)備的要求較低，操作過程更加方便、簡單，所需試劑無毒無害，提高了其應(yīng)用效率。樣品只需經(jīng)過簡單的處理便可利用HS-SPME進(jìn)行富集。

揮發(fā)性成分常見的檢測方法有：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)[12]、電子鼻技術(shù)[13]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)[14]。其中HPLC法操作簡單、進(jìn)樣量小、檢測準(zhǔn)確性高；電子鼻可以通過傳感器監(jiān)測成分的微小變化，反映樣品中整體揮發(fā)性化合物的信息，但傳感器具有選擇性、限制性，因此對于不同化合物需要更換不同傳感器，成本較高。GC-MS可用于痕量物質(zhì)分析，檢測靈敏度高，消耗溶劑少，但在進(jìn)行分析前需要進(jìn)行復(fù)雜的處理，所用時間較長[15]。

因此本實驗分別采用煎煮法、水蒸氣蒸餾法處理干香菇，兩種方法得到的香菇提取液的揮發(fā)性化合物的比較未見報道，特采用HS-SPME-GC-MS對干香菇游離態(tài)、鍵合態(tài)揮發(fā)性進(jìn)行分析比較，為香菇的風(fēng)味研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇：武漢海芳工貿(mào)發(fā)展有限公司。

正戊烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醚、二氯甲烷、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氯化鈉（均為分析純）、仲辛酮（純度≥99.9%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；安博萊特（Amberlite）XAD-2大孔吸附樹脂（粒徑0.25～0.83 mm）：美國Supelco公司；纖維二糖酶（130 U/g）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇提取液的制備

取100.0 g干香菇菌蓋置于粉碎機(jī)內(nèi)粉碎，稱取等量45.0 g香菇粉末分別放于兩個三頸燒瓶中，分別采用煎煮法和水蒸氣蒸餾法提取5 h，冷卻，減壓過濾，分別得到400 mL香菇提取液。

1.3.2 樣品中游離態(tài)揮發(fā)性組分的前處理

取8 mL香菇提取液置于20 mL頂空螺紋口樣品瓶中，再分別向其中加入2.0 g NaCl、磁力攪拌子，以20 μL仲辛酮（1.010 2 g/L）為內(nèi)標(biāo)制成游離態(tài)揮發(fā)性組分的待測樣品。兩種方法得到的香菇提取液各重復(fù)3次實驗，并直接用于GC-MS進(jìn)行檢測。

1.3.3 樣品中鍵合態(tài)揮發(fā)性組分的前處理

利用索氏提取法提取活化安博萊特XAD-2大孔吸附樹脂，正戊烷、乙酸乙酯、甲醇依次回流處理30.0 g樹脂，每個溶劑回流處理12 h，然后將甲醇作為溶劑濕法裝柱。

首先用1 000 mL去離子水平衡樹脂，洗至無醇味；上350 mL香菇提取液樣品，控制流速為3 mL/min，待提取液距離樹脂上端3 cm時關(guān)閉層析柱開關(guān)，靜置過一夜，依次用500 mL去離子水、400 mL乙醚-戊烷（1∶1，V/V）溶劑淋洗，除去水溶性的糖、酸、游離態(tài)揮發(fā)性化合物等；用450 mL甲醇對待測成分進(jìn)行洗脫并旋蒸至近干（水浴溫度35 ℃）。

配制0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH 5.2），將樣品少量多次的溶解在30 mL緩沖液中。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低殘存的游離態(tài)組分對結(jié)果的影響，因此用90 mL等體積比的二氯甲烷-正戊烷溶劑分3次進(jìn)行萃取。取下層水相加入500 mg纖維二糖酶進(jìn)行酶解，為保證酶的最佳活性，將樣品置于37 ℃恒溫箱中。酶解48 h后取8 mL溶解液置于20 mL頂空螺紋口樣品瓶中，再分別向其中加入2 g NaCl、磁力攪拌子，以20 μL仲辛酮（1.010 2 g/L）為內(nèi)標(biāo)制成鍵合態(tài)揮發(fā)性組分的待測樣品，重復(fù)3次，用于GC-MS檢測。

1.3.4 GC-MS 分析條件

基于前人的經(jīng)驗及對Einthoven三角定律的深入解讀[2-4]，我們嘗試尋找一種不用記憶大量錯接后心電圖形特點規(guī)律，僅畫圖就能快速準(zhǔn)確地判斷出心電圖的各類導(dǎo)聯(lián)錯接的方法，還原“犯罪現(xiàn)場”。

HS-SPME：50 ℃平衡30 min，50 ℃萃取80 min，解吸5 min。

GC條件：J&W HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣（He）流速1 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比5∶1。程序升溫：起始溫度60 ℃，以10 ℃/min升至110 ℃；以15 ℃/min升至140 ℃，保持10 min；以10 ℃/min升至180 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；以10 ℃/min升至280 ℃。

MS條件：離子源溫度230 ℃；電子電離（electron ionization，EI）源模式；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍45～550 u；掃描方式：全掃描；調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。

1.3.5 定性定量分析方法

利用GC-MS分析檢測，借助C6～C20正構(gòu)烷烴的保留時間計算色譜峰的保留指數(shù)（retention index，RI），參照美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）08數(shù)據(jù)庫對譜圖進(jìn)行初步檢索及質(zhì)譜分析，比對文獻(xiàn)報道的保留指數(shù)，對各個色譜峰輔助定性。

以20 μL仲辛酮的乙醇溶液（1.010 2 g/L）為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法定量。根據(jù)式（1）計算揮發(fā)性成分的含量[16]。

式中：xi表示組分含量，μg/L；ms表示內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度，μg/L；Ai表示化合物的峰面積；As表示內(nèi)標(biāo)物峰面積；fi表示待測組分對內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量校正因子（量綱為1）。

2 結(jié)果與分析

采用HS-SPME富集不同方法提取的干香菇菌蓋中揮發(fā)性成分，利用GC-MS對化合物進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，利用煎煮法得到的香菇提取液中游離態(tài)揮發(fā)性成分有41種，鍵合態(tài)揮發(fā)性成分有19種；利用水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液中游離態(tài)揮發(fā)性成分有42種，鍵合態(tài)揮發(fā)性成分有19種。

圖1 煎煮法（A、B）及水蒸氣蒸餾法（C、D）得到香菇提取液中揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in Lentinus edodes extract by decocting method (A,B) and steam distillation method (C,D) analyzed by GC-MS

由于流動相的極性大于固定相的極性，且根據(jù)圖1，對于游離態(tài)揮發(fā)性成分來說，保留時間較短的時候峰個數(shù)比較多，說明游離態(tài)揮發(fā)性成分中含極性較大的物質(zhì)種類比較多；對于鍵合態(tài)揮發(fā)性成分來說，保留時間較長的時候峰個數(shù)比較多，說明鍵合態(tài)揮發(fā)性成分中含極性較小的物質(zhì)種類比較多。

以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，解析干香菇菌蓋中揮發(fā)性成分的具體物質(zhì)及含量，結(jié)果如表1所示。

表1 干香菇揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 1 Analysis results of volatile components in dried Lentinus edodes

續(xù)表

續(xù)表

根據(jù)表1可得，兩種方法提取的干香菇中共同的游離態(tài)揮發(fā)性成分23種，共同的鍵合態(tài)揮發(fā)性成分14種。利用煎煮法得到的香菇提取液中，含有烴類（15種）、芳香類（6種）、醇類（6種）、酯類（12種）、醛類（4種）、酮類（9種）、含硫化合物（4種）等化合物，其中含硫化合物的含量最多；利用水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液中，烴類（11種）、芳香類（6種）、醇類（9種）、酯類（8種）、醛類（6種）、酮類（13種）、含硫化合物（4種）、呋喃（1種）等化合物，其中含硫化合物的含量最多。兩種方法都是游離態(tài)的種類及含量多于鍵合態(tài)，利用兩種方法得到的香菇提取液的揮發(fā)性成分有所差異，利用水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液中檢測到呋喃，而利用煎煮法得到的香菇提取液中未檢測到。

雖然香菇中含有眾多揮發(fā)性化合物，但起主要作用有兩類：以醇為主的八碳化合物和含硫化合物[17]。在脂肪氧化酶催化亞油酸時會產(chǎn)生有特征蘑菇風(fēng)味的八碳化合物[18]，其中最為突出的成分是1-辛烯-3-醇，在鮮香菇中有著特殊的地位，干香菇中亦可檢測到，但其含量低于鮮香菇。如表1所示，兩種不同方法處理的香菇的游離態(tài)中都可檢測到1-辛烯-3-醇，在利用煎煮法得到的香菇提取液的游離態(tài)中含量為4.05%，在利用水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液的游離態(tài)中含量為0.20%。含硫化合物是主要影響干香菇的風(fēng)味的物質(zhì)，如表1中二甲基二硫醚、1,2,3,5,6-五硫環(huán)庚烷等。香菇酸作為香菇中的前體化合物，在補(bǔ)谷氨酸基轉(zhuǎn)膚酶和半朧氨酸亞礬裂解酶的催化下，經(jīng)過二硫環(huán)丙烷中間體聚合成1,2,3,5,6-五硫環(huán)庚烷（香菇精）[19]。香菇精的熱穩(wěn)定性較差，容易受溫度的影響，在其形成的過程中伴隨著二甲基二硫醚等含硫化合物的產(chǎn)生[20]。

如表1所示，通過煎煮法、水蒸氣蒸餾法處理的干香菇菌蓋的游離態(tài)、鍵合態(tài)中，含硫化合物的含量分別為957 353.11 μg/L、0、960 704.71 μg/L、426 340.10 μg/L。不同處理方法影響香菇揮發(fā)性成分，劉璐等[21]研究發(fā)現(xiàn)，利用蒸汽漂燙、沸水漂燙處理鮮香菇大大影響了香菇中含硫化合物的相對含量，蒸汽燙漂鮮香菇，含硫化合物相對含量增至87.64%；香菇經(jīng)沸水燙漂，含硫化合物降為2.85%。本實驗采用煎煮的方式處理干香菇，得到的香菇提取液的含硫化合物含量為40.3%，經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的香菇提取液中含硫化合物的相對含量為39.5%。楊肖等[22]用不同方法處理香菇，用SPME-GC-MS技術(shù)檢測不同狀態(tài)香菇中的揮發(fā)性成分，總共檢測到72種揮發(fā)性成分。本實驗采用兩種不同方法處理干香菇，利用HS-SPME-GC-MS檢測分析，在干香菇菌蓋中得到79種揮發(fā)性成分。安晶晶等[23]采用SDE-GC-MS技術(shù)，從鮮香菇和干香菇兩種不同狀態(tài)的香菇出發(fā)，對其風(fēng)味成分進(jìn)行了對比。本實驗以干香菇為研究對象，研究了影響其風(fēng)味物質(zhì)的化合物含量，將鮮香菇加熱干燥制成干香菇的過程中，八碳化合物氧化分解，含量越來越少，相反，含硫化合物的含量增多，成為干香菇的重要風(fēng)味物質(zhì)。李文等[24]分析香菇不同階段特征性揮發(fā)性成分，在其6個生長階段中，總共檢測到134種起重要作用的揮發(fā)性化合物。本實驗分別采用煎煮法、水蒸氣蒸餾法提取干香菇菌蓋中揮發(fā)性成分，利用HS-SPME-GC-MS對揮發(fā)性成分進(jìn)行富集、檢測，不同方法處理的香菇得到的揮發(fā)性成分的含量和種類有所不同。香菇的揮發(fā)性成分種類繁多，正是由含硫化合物、以醇類為主的八碳化合物、醚類等物質(zhì)共同作用影響了香菇特殊的風(fēng)味[25]。

3 結(jié)論

通過采用HS-SPME-GC-MS對煎煮法、水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液進(jìn)行富集、檢測分析，分別檢測其游離態(tài)揮發(fā)性成分和鍵合態(tài)揮發(fā)性成分。利用煎煮法得到的香菇提取液的游離態(tài)揮發(fā)物41種，鍵合態(tài)揮發(fā)物19種；利用水蒸氣蒸餾法得到的游離態(tài)揮發(fā)物42種，鍵合態(tài)揮發(fā)物19種。分別利用煎煮法、水蒸氣蒸餾法得到的香菇提取液，揮發(fā)性成分的數(shù)量相近，但是在含量、種類上有所差異。相較于煎煮法，水蒸氣蒸餾法處理的香菇風(fēng)味更濃郁，主要是因為香菇提取液中揮發(fā)性成分的含量更高，尤其是決定干香菇特殊風(fēng)味物質(zhì)的含硫揮發(fā)性化合物的含量更高，如二甲基二硫醚、1,2,3,5,6-五硫環(huán)庚烷等，因此在對干香菇進(jìn)行精深加工時采用水蒸氣蒸餾法保證了香菇類產(chǎn)品濃郁的獨有風(fēng)味。不僅滿足了大眾對香菇風(fēng)味的需求，還為香菇的發(fā)展帶來經(jīng)濟(jì)效益。經(jīng)過HS-SPME吸附萃取，與GC-MS檢測分析，簡單快速、高靈敏度、高效的檢測到干香菇中揮發(fā)性組分，為開發(fā)香菇的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)品提供方法學(xué)的支撐。