胡伶俐，曾 超，肖 穎，劉長(zhǎng)輝*

(1. 湖南城市學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413000；2. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，長(zhǎng)沙 410007)

銅離子(Cu2+)是生物體內(nèi)一種不可或缺的微量元素，在生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用[1-2].人體內(nèi)Cu2+的缺乏會(huì)引發(fā)白細(xì)胞減少和骨質(zhì)疏松癥等疾病[3]，而過(guò)量的Cu2+則會(huì)損傷肝、腎等器官[4].已有研究表明，從食物、飲用水或其他來(lái)源吸收過(guò)量的Cu2+會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)衰弱等疾病[5-6].因此，開(kāi)發(fā)一種選擇性檢測(cè)水樣中Cu2+的方法具有非常重要的意義.近年來(lái)，傳統(tǒng)的高靈敏度、高選擇性Cu2+檢測(cè)方法，諸如原子吸收光譜法[7]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[8]等，引起了人們的廣泛關(guān)注.與傳統(tǒng)方法相比，熒光光譜法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注[9-12].

核酸熒光探針具有物理和化學(xué)特性穩(wěn)定、易合成等性質(zhì)，且核酸具有被核酸酶和羥基自由基切斷的特性[13-14].該探針已被應(yīng)用于酶活性[14-16]、DNA[17]、蛋白質(zhì)[18]及金屬離子[13,19-20]的檢測(cè).眾所周知，核酸與某些小分子、聚合物能夠產(chǎn)生聚集誘導(dǎo)效應(yīng)[21-23]，從而改變小分子染料的熒光發(fā)射光譜.抗癌藥物阿霉素(Dox)是一種具有熒光特性的有機(jī)分子，它在水相中能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，但在雙鏈DNA(dsDNA)中易被誘導(dǎo)聚集而使熒光淬滅[24-25].本文利用Dox 在dsDNA 中聚集后的熒光淬滅和過(guò)氧化氫(H2O2)與Cu2+間發(fā)生芬頓反應(yīng)所產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)切斷dsDNA 的機(jī)理，構(gòu)建了一種選擇性檢測(cè)水相中Cu2+的熒光分析方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

U-3010 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；F-4600 型熒光光度計(jì)(日本島津公司).

DNA(生工生物工程(上海)股份有限公司)，其他試劑購(gòu)自北京百靈威科技有限公司，所用試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為超純水系統(tǒng)(Barnstead/Thermolyne Corp., Dubuque, IA)制備的超純水(18.2 MΩ·cm).

1.2 dsDNA 母液配制

取200 μmol/L 互補(bǔ)單鏈DNA 各125 μL，加入48 μL HEPES 緩沖溶液(10 mmol/L，pH=7.0)；繼續(xù)加入1.5 μL MgCl2溶液(1.0 mol/L)和0.5 μL KCl 溶液(5.0 mol/L)；于沸水浴中加熱5 min 后，放入冰箱上層冷卻，制得dsDNA 母液，備用.

1.3 光譜測(cè)定

在比色皿中加入10 mmol/L HEPES 緩沖液400 μL，再加Dox 溶液(5.0 mmol/L)5.0 μL；繼續(xù)加入一定量的dsDNA 母液、0.5 mmol/L H2O2和一定量的Cu2+溶液，測(cè)定其紫外-可見(jiàn)吸收光譜；以480 nm 作為激發(fā)波長(zhǎng)，保持狹縫為10 nm/10 nm 不變，測(cè)定其熒光發(fā)射光譜.

1.4 Cu2+含量測(cè)定

測(cè)定方法同1.3，用0.5 mL 待測(cè)液替代Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)計(jì)算樣品中的Cu2+濃度.每份樣品平行測(cè)定3 次.

2 結(jié)果與討論

2.1 銅離子核酸探針的構(gòu)建

為了考察Dox 與dsDNA 作用前后的光物理性質(zhì)的變化情況，在HEPES(10 mmol/L，PH=7.0)緩沖溶液中加入5.0 L 的Dox 溶液(5.0 mmol/L)，再加入一定量的dsDNA 母液，測(cè)定其紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖1 所示.

由圖1A 可知，Dox 在480 nm 處展現(xiàn)特征吸收；dsDNA 的加入使其在260 nm 處產(chǎn)生了DNA的特征吸收峰；芬頓試劑(H2O2+Cu2+)的加入使得260 nm 處的吸收峰形狀發(fā)生了明顯變化，但480 nm處的吸收峰形狀保持不變.圖1B則表明，Dox在550 和590 nm 處產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號(hào)，且隨著dsDNA 的加入，熒光信號(hào)顯著減弱，而芬頓試劑(H2O2+Cu2+)又使體系的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng).其原因可能是：Dox 具有聚集誘導(dǎo)熒光淬滅的性質(zhì)，其分子嵌入dsDNA 的空隙后形成聚集態(tài)，導(dǎo)致了熒光淬滅；而芬頓試劑產(chǎn)生的·OH 切斷了DNA，釋放出Dox，使體系的熒光增強(qiáng).這表明核酸探針(Dox/dsDNA)被成功構(gòu)建.

圖1 Dox 加入dsDNA 和芬頓試劑(H2O2+Cu2+)前后的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(A)和熒光發(fā)射光譜(B)

2.2 可行性研究

為了驗(yàn)證該檢測(cè)體系的可行性，在HEPES(10 mmol，pH=7.0)緩沖溶液中，固定H2O2含量(0.5 mmol/L)，考察探針Dox/dsDNA 與芬頓試劑的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖2 所示.

由圖2A 可知，Dox/dsDNA 在550 和590 nm處的熒光強(qiáng)度很弱，加入H2O2和Cu2+對(duì)其熒光信號(hào)的變化可以忽略不計(jì)，芬頓試劑(H2O2+Cu2+)的加入?yún)s使體系的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng).由圖2B發(fā)現(xiàn)，Dox 展現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)；dsDNA 的加入使體系的熒光信號(hào)顯著減弱；H2O2的加入對(duì)體系的熒光信號(hào)無(wú)影響；Cu2+的加入?yún)s使體系的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，且響應(yīng)速率快(＜100 s)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu2+的快速檢測(cè).其原因可能是H2O2和Cu2+發(fā)生芬頓反應(yīng)產(chǎn)生·OH 切斷了DNA，破壞了其聚集狀態(tài)并釋出Dox 分子，從而恢復(fù)了Dox 的熒光.

圖2 探針Dox/dsDNA 加入H2O2、Cu2+和H2O2/Cu2+前后的熒光發(fā)射光譜(A)；Dox 加入dsDNA 和H2O2/Cu2+后的熒光響應(yīng)速率(B)

2.3 dsDNA 長(zhǎng)度對(duì)Cu2+響應(yīng)的影響

在HEPES(10 mmol，pH=7.0)緩沖溶液中加入含不同堿基數(shù)的dsDNA 與Dox 作用，再與Cu2+響應(yīng)，考察dsDNA 的長(zhǎng)度對(duì)體系熒光恢復(fù)程度的影響，結(jié)果如圖3 所示.

圖3 dsDNA 長(zhǎng)度對(duì)探針Dox/dsDNA 加入Cu2+前后的熒光恢復(fù)程度的影響

由圖3 可知，固定Dox 的濃度，加入不同堿基數(shù)的dsDNA 均可使Dox 的熒光信號(hào)展現(xiàn)不同程度的淬滅現(xiàn)象，Cu2+的加入則使體系的熒光信號(hào)均有不同程度的恢復(fù)；當(dāng)dsDNA 為15 個(gè)堿基時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度增幅最大.因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇的dsDNA 長(zhǎng)度均為15 個(gè)堿基.

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，依次加入Fe3+、Zn2+、Mg2+、Al3+、Ag+、Cu2+、Ca2+、Hg2+、Cl-、Na+、F-、K+、CO32-、Ni2+、SO42-、PO43-、HPO42-、Pb2+、ClO-和NO3-等常見(jiàn)離子，分別考察體系熒光信號(hào)的變化情況，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 探針Dox/dsDNA 對(duì)常見(jiàn)離子的響應(yīng)

由圖4 可以看出，僅有Cu2+展現(xiàn)顯著的熒光增強(qiáng).此結(jié)果表明，探針Dox/dsDNA 僅在芬頓試劑中有響應(yīng)，可選擇性檢測(cè)Cu2+.

2.5 Cu2+檢測(cè)

在HEPES(10 mmol，pH=7.0)緩沖溶液中，固定H2O2含量(0.5 mmol/L)，考察Cu2+濃度對(duì)探針Dox/dsDNA 的影響，結(jié)果如圖5 所示.

圖5 探針Dox/dsDNA 對(duì)不同Cu2+濃度的響應(yīng)(A)；Cu2+濃度與體系熒光強(qiáng)度變化的關(guān)系(B)

由圖5A 可知，體系在480 和590 nm 處展現(xiàn)較弱的熒光信號(hào)；隨著Cu2+濃度的增加，480 和590 nm 處的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)；當(dāng)Cu2+濃度為100 mol/L 時(shí)，在590 nm 處的熒光強(qiáng)度增加了9.7倍.由圖5B 可知，當(dāng)Cu2+濃度為1.0～50.0 mol/L時(shí)，體系熒光強(qiáng)度的變化程度與Cu2+濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其回歸方程為y=1.059x+0.115 8，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=0.992 6，檢測(cè)限為0.3 mol/L.這表明該Dox/dsDNA 探針可有效檢測(cè)Cu2+.

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

在HEPES(10 mmol，pH=7.0)緩沖溶液中，固定H2O2含量(0.5 mmol/L)，將Dox/dsDNA 探針用于飲用水中Cu2+的檢測(cè)，結(jié)果如表1 所示.

表1 飲用水中Cu2+的檢測(cè)

由表1 可以看出，Dox/dsDNA 探針對(duì)Cu2+的加標(biāo)回收率為97.0%～101.2%，獲得了滿(mǎn)意的測(cè)定結(jié)果.因此，核酸探針Dox/dsDNA 可有效地測(cè)定實(shí)際樣品中的Cu2+含量.

3 結(jié)論

根據(jù)dsDNA 誘導(dǎo)Dox 聚集并淬滅其熒光信號(hào)，以及Cu2+與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 可以切斷DNA 而恢復(fù)Dox 熒光信號(hào)的機(jī)理，建立了核酸探針選擇性檢測(cè)Cu2+的熒光分析方法.結(jié)果表明，當(dāng)Cu2+濃度為1.0～50.0 mol/L 時(shí)，其與檢測(cè)體系的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限為0.3 mol/L.該體系響應(yīng)速率快(＜100 s)、選擇性好、靈敏度高，且具有較強(qiáng)抗干擾能力，可用于實(shí)際水樣的Cu2+檢測(cè).由于該探針的構(gòu)建是通過(guò)Dox 與dsDNA 間的嵌合作用，故其穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高.