王仕林，孫遠征，于天洋，孫 妍△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一類成年發(fā)病，病變累及脊髓前角細胞、錐體束和延髓，出現(xiàn)肌無力、肌萎縮和肌束震顫等臨床表現(xiàn)的神經(jīng)變性疾病[1-2]。ALS病情進展較快，患者多在發(fā)病后3～5年內(nèi)死于呼吸肌麻痹[3]。盡管ALS的發(fā)病機制目前尚不十分明確[4-5]，但部分研究[6]認為ALS的發(fā)病與神經(jīng)炎癥反應密切相關。在多種神經(jīng)變性疾病中都能夠觀察到具有促炎作用的小膠質(zhì)細胞中的Toll受體4(Toll-like receptors 4, TLR4)的異常表達[7-8]，TLR4通過識別病原因子，激活細胞核內(nèi)的核因子-κB(Nuclear factor-kappa B, NF-κB)使其在細胞核內(nèi)大量釋放，介導如白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)等一系列炎癥因子在細胞內(nèi)高表達，加重神經(jīng)炎癥反應，繼而導致神經(jīng)變性的進一步加劇[9-10]。ALS-SOD1G93A小鼠是經(jīng)典的ALS動物模型，目前國內(nèi)外動物實驗中多在ALS-SOD1G93A小鼠50～70日齡時進行干預，此時小鼠多尚未發(fā)病或病情較輕，若干預時間超過90日齡則治療效果多不盡人意[11-12]。在臨床實踐中，ALS患者往往在出現(xiàn)明顯的臨床癥狀后才前往醫(yī)院就診，延誤了最佳治療時間，而針灸早期介入能否改善ALS患者的預后是值得深入探討和研究的問題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[13-15]夾脊電針可以延緩ALS-SOD1G93A小鼠的病情進展，改善臨床癥狀，對ALS的治療具有積極作用。故本研究通過觀察夾脊電針在小鼠60日齡和90日齡兩個不同時間點干預對ALS-SOD1G93A小鼠發(fā)病時間、肢體運動功能與脊髓前角運動神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量變化及TLR4、NF-κB和IL-1β蛋白表達的影響，探究夾脊電針對ALS-SOD1G93A小鼠的最佳干預時間及機制，為臨床上選擇治療ALS的最佳時間提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

4只雄性ALS hSOD1-G93A-1Gur/J轉(zhuǎn)基因鼠與20只雌性B6SJL/F1品系健康鼠雜交擴群。實驗鼠由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心[動物許可證號：SYXK(黑)2016004]提供。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心SPF級動物實驗室。實驗室內(nèi)環(huán)境：(22±2)℃恒溫,40%～50%恒濕,無特殊病原體。由通過專業(yè)培訓的實驗動物飼養(yǎng)人員進行喂養(yǎng)、繁殖，自由攝食滅菌水及顆粒型無菌鼠類飼料。于子代鼠30日齡時行PCR鑒定，將攜帶hSOD1-G93A基因的轉(zhuǎn)基因鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組、90 d夾脊電針組和60 d夾脊電針組，12只/組。將不攜帶hSOD1-G93A基因的陰性鼠隨機選取12只作為野生組。各組小鼠60日齡時體質(zhì)量(16.97±0.62)g。實驗過程中對小鼠的操作均符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[16]中的規(guī)定。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 HANS-100A神經(jīng)刺激儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司);SA102型轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(江蘇賽昂斯生物科技有限公司);HS-3345切片機(華速醫(yī)療器械有限公司);GZX-DH-Ⅱ電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);FD-268復合光學顯微鏡(Leica公司);NB-70型制冰機(上海雪人);凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司);Multifuge X1R型離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司);TZL-50001型水平搖床(蘇州珀西瓦爾實驗設備公司);TG16-W型漩渦混勻器(美國Benchmark公司);BCA蛋白試劑盒(碧云天技術有限公司);SpectraMax i3x型多功能酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2.2 主要試劑 4 %多聚甲醛(碧云天技術有限公司);蘇木素—伊紅染液(Biosharp);二甲苯(天津市富宇精細化工有限公司);甲苯胺藍(上海麥克林生化科技有限公司);中性樹脂(上海麥克林生化科技有限公司);TBST(索寶萊生物制劑有限公司);SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(碧云天技術有限公司);蛋白Marker(Thermo Fisher Scientific);蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich);GAPDH抗體(Sigma-Aldrich);TLR4抗體(Cell Signaling Technology);NF-κB抗體(Cell Signaling Technology);IL-1β抗體(Cell Signaling Technology)。

1.3 干預方法

60 d夾脊電針組和90 d夾脊電針組分別于小鼠60日齡和90日齡時，在異氟烷(流量0.6 L/min，濃度1 %)麻醉條件下將小鼠固定在無菌操作臺，采用針灸針(0.16 mm×7 mm，珞亞山川牌)直刺小鼠雙側(cè)L1～2、L5～6夾脊穴，針刺深度2～3 mm。HANS-100A神經(jīng)刺激儀正負極連接同側(cè)兩穴，頻率2 Hz，電流強度1 mA，治療20 min/次，2次/周，治療4周。模型組和野生組小鼠于60日齡時，給予相同條件的麻醉和固定，不進行針刺干預。

1.4 標本采集和保存

在各組小鼠120日齡時取材，隨機抽取6只，4 %水合氯醛腹腔注射麻醉，0.9% NaCl(50 mL/只)和4 %多聚甲醛(40 mL/只)灌注，剝離脊髓，截取腰段，甲醛固定，石蠟包埋后-4 ℃保存，用于HE染色和尼氏染色檢測。各組剩余6只鼠，4 %水合氯醛腹腔注射麻醉，0.9% NaCl(50 mL/只)灌注后，迅速剝離新鮮腰髓，置凍存管-80 ℃保存，用于Western Blot檢測。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 觀察各組小鼠發(fā)病時間 小鼠60日齡時通過懸尾實驗觀察小鼠后肢伸展情況，判定發(fā)病日期[17]。懸尾實驗時小鼠后肢表現(xiàn)為不能完全伸展，偏離中線，一側(cè)肢體微屈曲或肢體震顫，連續(xù)重復3～4次且連續(xù)2 d，即判定當日為小鼠發(fā)病日，評定由固定的兩名實驗人員共同完成并記錄數(shù)據(jù)。

1.5.2 各組小鼠轉(zhuǎn)棒實驗測試 在各組小鼠55日齡時，用轉(zhuǎn)棒式疲勞儀對小鼠進行連續(xù)5 d的適用性訓練，設置轉(zhuǎn)速為15 r/min，180 s/次，3次/d。適用性訓練結(jié)束后，正式進行轉(zhuǎn)棒實驗的測試，轉(zhuǎn)速15 r/min，180 s/次，每個測試日進行3次測試，3次中取表現(xiàn)最佳的1次記為結(jié)果，每周記錄2次。

1.5.3 HE染色觀察小鼠腰髓前角運動神經(jīng)元形態(tài) 石蠟切片(厚度4 μm)，37 ℃溫箱隔夜貼片后行HE染色。組織切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟，逐級酒精脫苯，蘇木素染色，鹽酒分化2 s，氨水反藍50 s，流水沖洗3 min后0.5%伊紅染色7 min，蒸餾水2～3 s后逐級酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察小鼠腰髓前角運動神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞漿、細胞質(zhì)及細胞核著色度，神經(jīng)元空泡化程度等病理表現(xiàn)。

1.5.4 尼氏染色觀察小鼠腰髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量 石蠟切片(厚度4 μm)，37 ℃溫箱隔夜貼片后，組織切片依次經(jīng)2次二甲苯各10 min脫蠟→逐級酒精各3 min脫苯→1%甲苯胺藍1 h(60 ℃溫箱)→蒸餾水2～3 s→逐級酒精脫水，二甲苯透明→中性樹脂封片→干燥后鏡下觀察染色情況。每只鼠腰髓染色10張片，隨機抽5張取平均值作為每例神經(jīng)元計數(shù)值(個/HP)記錄。神經(jīng)元細胞的計數(shù)評判標準：細胞體多極化，神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞質(zhì)顆粒狀，核仁清晰完整，只要滿足以上特點，無論神經(jīng)元大小均計為1個神經(jīng)元。

1.5.5 Western Blot法檢測小鼠腰髓TLR4、NF-κB及IL-1β表達量 組織研磨后，加入150 μL RIPA裂解液、150 μL PMST蛋白酶抑制劑，提取蛋白→BCA蛋白測定→沸水煮5 min，蛋白變性→SDS-PAGE凝膠制備→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→抗體孵育→化學發(fā)光后成像保存圖像。采用Image J v1.8.0對經(jīng)掃描后保存的條帶圖片進行分析測定，計算IOD值，定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同時間點夾脊電針干預對各組小鼠發(fā)病期的影響

與模型組比較，90 d夾脊電針組發(fā)病時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與90 d夾脊電針組比較，60 d夾脊電針組發(fā)病時間明顯推遲，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠發(fā)病時間比較

2.2 不同時間點夾脊電針干預對各組小鼠轉(zhuǎn)棒時間的影響

各組小鼠發(fā)病前轉(zhuǎn)棒時間均為180 s，自90日齡起，與野生組比較，其他各組轉(zhuǎn)棒時間降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組和90 d夾脊電針組比較，60 d夾脊電針組轉(zhuǎn)棒時長開始降低時間明顯延后，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且60 d夾脊電針組相同時間點的轉(zhuǎn)棒時間均長于模型組和90 d夾脊電針組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠轉(zhuǎn)棒時間比較

2.3 HE染色后各組小鼠腰髓前角運動神經(jīng)元形態(tài)學變化

野生組腰髓切片染色均勻，細胞形態(tài)完整，細胞質(zhì)呈顆粒狀，核仁清晰完整，無神經(jīng)元細胞空泡、水腫等病理損害的特異性表現(xiàn)；模型組腰髓前角組織疏松，大量細胞形態(tài)不完整，結(jié)構(gòu)破壞，核仁邊緣不清，有固縮現(xiàn)象,可見明顯的空泡和水腫等神經(jīng)損傷的特異性表現(xiàn)；與模型組比較，60 d夾脊電針組和90 d夾脊電針組神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，但染色仍然存在不均勻，脊髓前角細胞有空泡和輕度的水腫表現(xiàn)；與90 d夾脊電針組比較，60 d夾脊電針組神經(jīng)元形態(tài)基本完整，相對比較清晰，存在少數(shù)染色不清的細胞，細胞空泡化和水腫程度明顯降低。見圖1。

2.4 各組小鼠腰髓前角運動神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果

與野生組比較，模型組、60 d夾脊電針組和90 d夾脊電針組脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，60 d夾脊電針組和90 d夾脊電針組脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05)；與90 d夾脊電針組比較，60 d夾脊電針組脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 各組小鼠腰髓前角運動神經(jīng)元計數(shù)比較

2.5 Western Blot法觀察腰髓TLR4、NF-κB及IL-1β相對表達量

與野生組比較，其他各組TLR4、NF-κB及模型組、90 d夾脊電針組IL-1β相對表達量均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，60 d夾脊電針組IL-1β相對表達量增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，90 d夾脊電針組和60 d夾脊電針組TLR4及60 d夾脊電針組IL-1β相對表達量均顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，90 d夾脊電針組和60 d夾脊電針組的NF-κB及90 d夾脊電針組的IL-1β相對表達量均減少，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與90 d夾脊電針組比較，60 d夾脊電針組TLR4、NF-κB及IL-1β相對表達量均減少，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖3、表4。

表4 各組小鼠腰髓TLR4、NF-κB及IL-1β相對表達量比較

3 討論

ALS在中醫(yī)學內(nèi)尚無準確病名，因ALS的臨床表現(xiàn)為肢體無力、運動遲緩、肌肉萎縮、肌束震顫和呼吸肌麻痹等癥狀，多將ALS歸屬中醫(yī)里的“痿證”范疇；延髓受累時多歸為“喑痱證”范疇。ALS的中醫(yī)治療主要包括“治痿獨取陽明”“夾脊穴論治”“從督論治”等不同治療原則，其中夾脊電針以其確切的臨床療效得到了廣泛的應用，本課題組前期研究證實[18-20]，夾脊電針對ALS具有積極治療作用，能夠有效抑制ALS小鼠運動神經(jīng)元細胞的損害，延緩疾病的發(fā)生發(fā)展，延長小鼠生存期。夾脊穴是與經(jīng)絡臟腑直接相互轉(zhuǎn)輸流注氣血的腧穴，位于“督脈之別”的走行位置，而“督脈之別”的循行又“別走太陽”，與足太陽膀胱經(jīng)相聯(lián)系。它依靠督脈和足太陽膀胱經(jīng)，通過氣街之經(jīng)氣的共同通路發(fā)揮包括背俞穴在內(nèi)的其他腧穴不能達到的調(diào)理樞紐作用[21-22]。該作用讓夾脊穴在治療神經(jīng)系統(tǒng)病變、臟腑病變等疑難雜癥方面具有獨特的療效。故本課題組采用夾脊電針治療來探究不同時間點的干預對ALS-SOD1G93A小鼠腰髓TLR4/NF-κB炎癥通路影響。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，90 d夾脊電針組和60 d夾脊電針組小鼠的轉(zhuǎn)棒時間和神經(jīng)元數(shù)量均增加，神經(jīng)元形態(tài)有所改善,提示夾脊電針可以改善ALS-SOD1G93A小鼠的下肢運動功能，減輕脊髓前角運動神經(jīng)元的損傷程度，保護神經(jīng)元，這與課題組既往研究一致。同時，本研究結(jié)果顯示，60 d夾脊電針組的效果優(yōu)于90 d夾脊電針組，提示發(fā)病前的早期干預療效可能優(yōu)于發(fā)病后干預。

神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)中由小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞激活的免疫應答反應，小膠質(zhì)細胞作為CNS中的免疫細胞，其與星形膠質(zhì)細胞在CNS中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[23]。Javier H. Jara等[24]研究ALS患者運動皮層中星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增生的情況。在患者運動皮層和TDP-43小鼠模型中檢測到被激活的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，特別是桿狀小膠質(zhì)細胞，證實ALS和神經(jīng)炎癥可能存在密切相關性。SOD1突變基因能夠激活小膠質(zhì)細胞TLR4/NF-κB炎性通路，TLR4激活后通過一系列分子反應迅速激活NF-κB，使其在核內(nèi)釋放，細胞核內(nèi)的NF-κB含量增加，介導IL-1β、IL-2和TNF-α等多種促炎細胞因子表達[25-26]，機體出現(xiàn)神經(jīng)炎癥表現(xiàn)。炎癥反應會引起神經(jīng)元的病理壞死，損傷壞死的脊髓前角神經(jīng)元可再次活化小膠質(zhì)細胞，加劇炎癥反應，從而使ALS病情持續(xù)進展。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，90 d夾脊電針組和60 d夾脊電針組脊髓前角細胞內(nèi)TLR4、NF-κB和IL-1β表達量均明顯降低，且60 d夾脊電針組內(nèi)各蛋白因子相對表達量低于90 d夾脊電針組，提示夾脊電針可能通過抑制ALS小鼠體內(nèi)致炎因子和炎癥因子的表達以減輕炎癥，改善ALS-SOD1G93A小鼠的疾病癥狀，且發(fā)病前的早期干預療效可能優(yōu)于發(fā)病后干預。

ALS的治療時機一直以來都是科學界探討的熱點話題，大部分實驗研究證明越早進行干預治療效果越佳，若能夠在發(fā)病前干預可能對疾病的預后具有積極意義[27-28]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》強調(diào):“上工治未病，不治已病”，治未病是中醫(yī)治療的重要思想，在許多疾病的治療中都得到了廣泛的應用。雖然本實驗證實了60 d發(fā)病前的早期干預可能優(yōu)于發(fā)病后的90 d干預，但實驗設計僅做了干預后相關通路中分子的變化研究，缺少拮抗或激動通路中關鍵分子的驗證實驗，機制研究比較初步。課題組后期將進一步深入完善，為臨床夾脊電針治療ALS提供更加全面可靠的實驗依據(jù)。

綜上所述，本研究以TLR4/NF-κB炎癥通路為切入點探究夾脊電針不同時間點干預治療ALS-SOD1G93A小鼠的疾病機制，結(jié)果顯示夾脊電針可能通過降低TLR4、NF-κB和IL-1β的相對表達量，減輕炎癥反應，保護神經(jīng)元，延緩小鼠發(fā)病時間，改善其下肢運動功能，且發(fā)病前早期干預療效更優(yōu)，為夾脊電針早期介入ALS的治療提供了相關理論依據(jù)。