李道霞，周 佳，姚 歡，余曉琴，周春芳，張定秋，李澍才

（四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川成都 611731）

《中國居民膳食指南》中推薦成人每日蔬菜攝入量為300～500 g[1]，蔬菜在日常飲食中所占比重較大。但蟲害問題嚴(yán)重影響了蔬菜的質(zhì)量，農(nóng)藥因具有防治病蟲害及調(diào)節(jié)植物生長的功效，在蔬菜種植過程中發(fā)揮著重要作用[2]。然而，長期用藥會(huì)使害蟲和病原微生物產(chǎn)生耐藥性，為確保蔬菜質(zhì)量，通常需要加大用藥濃度、增加噴灑次數(shù)或多農(nóng)藥聯(lián)合使用等方式對病蟲害進(jìn)行防治[3]。不合理或不合規(guī)的用藥方式，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留問題日益嚴(yán)重，這不僅引起環(huán)境污染問題，還嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的健康[4]。近年來，我國對農(nóng)藥殘留問題越來越重視，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)不定期地更新農(nóng)藥的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，在2021 年版中對564 種農(nóng)藥的10 092 項(xiàng)最大殘留限量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定[5]，但農(nóng)藥殘留超標(biāo)現(xiàn)象仍屢禁不止，多農(nóng)藥殘留問題也日益突出[6]，因此對多農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的要求進(jìn)一步提高，制定快速、準(zhǔn)確、靈敏的多農(nóng)藥殘留檢測方法具有重要意義。

目前農(nóng)藥殘留檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[7]、液相色譜法（liquid chromatography，LC）[8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法[9-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[12-14]等。GC 法和LC 法由于檢測器限制，同時(shí)檢測的農(nóng)藥種類有限，且易受雜質(zhì)或共存物干擾，準(zhǔn)確性相對較差；GC-MS/MS 法雖具有較高的準(zhǔn)確度，但在分析較高沸點(diǎn)或低相對分子質(zhì)量的農(nóng)藥時(shí)，易受基質(zhì)效應(yīng)、柱流物等因素影響而導(dǎo)致靈敏度較低或產(chǎn)生干擾現(xiàn)象；LC-MS/MS 法靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，在多農(nóng)藥殘留檢測中應(yīng)用十分廣泛。目前，LC-MS/MS 法多與QuECHERS 前處理技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于多農(nóng)藥殘留檢測[15-17]。dMRM是在多反應(yīng)監(jiān)測模式（multi-reactionmonitoring，MRM）基礎(chǔ)上以目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確保留時(shí)間為中心設(shè)置采集時(shí)間窗，即儀器僅在各目標(biāo)化合物保留時(shí)間前后一段時(shí)間內(nèi)掃描其特征離子對，其優(yōu)勢是根據(jù)儀器分析時(shí)間對每個(gè)化合物的采集時(shí)間窗口進(jìn)行動(dòng)態(tài)分配，僅在設(shè)定的時(shí)間窗內(nèi)采集相應(yīng)的目標(biāo)組分，這種科學(xué)的采集方式可有效減少同時(shí)采集的離子對數(shù)目，并在一定程度上提高了駐留時(shí)間，有效地提高了整個(gè)采集時(shí)間內(nèi)的分析效率[12]。

本研究采用QuEChERS 前處理方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了同時(shí)測定蔬菜中327 種農(nóng)藥的一種方法，其前處理簡單、快速，同時(shí)測定的化合物涵蓋了有機(jī)磷類、有機(jī)氯類殺蟲劑、三唑類殺菌劑、苯氨基嘧啶類除草劑和殺蟲劑等多種農(nóng)藥，使用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式，提高了分析靈敏度，適用于蔬菜中農(nóng)藥殘留的高通量快速篩查和定量檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙腈、甲醇、甲酸，色譜純，德國默克公司；乙腈、甲酸、乙酸、無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉、乙酸鈉，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水（GB/T 6682 規(guī)定的一級水）；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18），Angilent 公司，美國。蔬菜購自成都實(shí)體超市。陶瓷均質(zhì)子，Angilent 公司，美國。

農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：10 μg/mL，購自天津阿爾塔科技有限公司（貨號分別為1ST29392-10B、1ST29766-10B、1ST29394-10B、1ST29386-10T、1ST29395-10A、1ST29387-10B、1ST29390-10A、1ST020032-10A、1ST29551-10M、1ST020414-10A、1ST29398-10A）。

1.2 儀器與設(shè)備

配有電噴霧離子源的Angilent LC1290-6460 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Angilent 公司，美國。色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，100 mm×2.1 mm），Waters 公司，美國。漩渦振動(dòng)器，IKA 公司，德國。Milli-Q高純水發(fā)生器，Millipore 公司，美國。離心機(jī)，SIGMA 公司，德國。氮吹儀，中國杭州奧盛科學(xué)儀器有限公司；0.22 μm 濾膜，北京泰科瑞迪國際貿(mào)易。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

精密量取各農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，氮?dú)鈸]去溶劑后用乙腈定容至10 mL，配制成各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，臨用新制。

1.4 樣品制備

稱取5.0 g 均勻樣品，置于50 mL 離心管中，精密加入1%甲酸乙腈20 mL，渦旋混勻1 min 后，-20 ℃冷凍10 min，加入QuEchERs 提取包（4 g 無水硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸二鈉）和1 顆陶瓷均質(zhì)子，振蕩提取2 min 后超聲10 min，6 000 r/min 離心5 min。取上清液7 mL 至含QuEchERs 凈化試劑（900 mg 無水硫酸鎂、150 mg PSA，含色素較多時(shí)采用900 mg 無水硫酸鎂、150 mg PSA、15 mg GCB）的離心管中渦旋1 min，6 000 r/min 離心5 min 后精密吸取上清液5 mL，于40 ℃氮吹至近干，精密加入1.0 mL 乙腈溶解殘?jiān)?，過0.22 μm 濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；流速0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；以0.1%甲酸水為流動(dòng)相A，0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫，洗脫程序（B%）：0～0.5min，10%；0.5～7min，10%～50%；7～21 min，50%～100%；21～23 min，100%，23～23.1 min，100%～10%；23.1～26 min，10%。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離，正負(fù)離子模式同時(shí)監(jiān)測（ESI±）；質(zhì)譜監(jiān)測方式：動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式（dMRM）；噴霧電壓4 000 V；輔助氣氣化溫度300 ℃；鞘氣流速11 L/min；鞘氣溫度300 ℃；干燥氣流速10 L/min。327 種農(nóng)藥的質(zhì)譜條件具體見表1。

1.6 回收率計(jì)算

回收率計(jì)算公式見式（1）[18]。

式中，c為加標(biāo)樣品測得濃度，ng/mL；V為樣品最終定容體積，mL；n為添加量，ng。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理軟件 Angilent MassHunter B.08.01。

2 試驗(yàn)方法建立、條件優(yōu)化及選擇

2.1 dMRM 模式下農(nóng)藥殘留檢測方法的建立

通過查閱標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室自建農(nóng)藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫搜索各目標(biāo)化合物的特征離子碎片和碰撞能量，通過多反應(yīng)監(jiān)測模式采集獲得每個(gè)化合物的保留時(shí)間，針對部分化合物采用手動(dòng)方式進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，根據(jù)獲得的保留時(shí)間等信息建立327 種農(nóng)藥基于動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式的采集方法。該方法通過調(diào)整多化合物采集時(shí)負(fù)載循環(huán)時(shí)間，以提高靈敏度。dMRM監(jiān)測模式下100 ng/mL芹菜基質(zhì)中327 種農(nóng)藥的提取離子流色譜圖見圖1。

圖1 芹菜基質(zhì)中327 種農(nóng)藥的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 327 pesticides in the celery matrix

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

以含色素和水分適中的芹菜為基質(zhì)，以回收率為指標(biāo)分別對提取溶劑、提取試劑包和凈化試劑包的條件進(jìn)行優(yōu)化，并將優(yōu)化后的檢測方法應(yīng)用于豇豆基質(zhì)。

2.2.1 提取溶劑的選擇

本研究的目標(biāo)化合物包含了有機(jī)磷、有機(jī)氯、三唑類、擬除蟲菊酯類和酰胺類等327 種農(nóng)藥，涉及種類多、極性差異大，因此篩選適合大多數(shù)農(nóng)藥的提取溶劑尤為重要。在提取農(nóng)藥時(shí)，盡可能地提取出目標(biāo)物和盡量去除樣品的雜質(zhì)是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，而蔬菜含有大量色素，對農(nóng)藥殘留檢測影響較大，現(xiàn)有農(nóng)殘類檢測標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道中多采用丙酮[19]、乙腈[20]和1%甲酸乙腈[21]作為提取溶劑，因此本研究考察了丙酮、乙腈和1%甲酸乙腈的提取效果，由圖2 可知，當(dāng)丙酮作為提取溶劑時(shí)，提取液中含有較多雜質(zhì)，對目標(biāo)物峰型影響校大，這可能是由于丙酮的溶解性很強(qiáng)造成的；乙腈由于其對農(nóng)藥溶解性較強(qiáng)，同時(shí)對親脂性色素等雜質(zhì)溶解度小，提取液中的色素顯著少于丙酮提取液；丙酮提取回收率為0.1%～168.9%，乙腈的提取回收率為0.8%～160.2%，1%甲酸乙腈提取回收率為28.4%～130.9%。試驗(yàn)表明，1%甲酸乙腈的提取效果最好，乙腈次之，丙酮最差。在乙腈中加入甲酸后，93.9%的農(nóng)藥回收率與乙腈差異不大，但2,4-滴丁酸、氟甲喹和磺草唑胺等20 種化合物的回收率顯著提高，圖3 中列舉了兩種提取溶劑回收率差異較大的20 種化合物的回收率，因此選擇1%甲酸乙腈作為提取溶劑。

圖2 三種提取溶劑的整體提取效果Fig.2 Overall extraction effect of three extraction solvents

圖3 不同溶劑的回收率對比Fig.3 Recoveries of the different solvent extracts

2.2.2 提取試劑包的選擇

研究比較了提取試劑Ⅰ（組成為4.0 g 無水硫酸鎂、1.0 g 氯化鈉、1.0 g 檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸二鈉）、提取試劑Ⅱ（組成為6.0 g 無水硫酸鎂、1.5 g 乙酸鈉）的提取效果，結(jié)果顯示兩種鹽包對目標(biāo)化合物的整體提取效果差異不大，其中回收率在70%～120%之間的化合物占總化合物數(shù)量的百分比分別為92.0%和91.1%，如圖4 所示，但提取試劑Ⅰ對滅草煙、丁酰肼和十二環(huán)嗎啉等8 種化合物的提取效果明顯優(yōu)于提取試劑Ⅱ，如圖5 所示。綜合考慮回收率情況選擇提取試劑Ⅰ的組成比例作為提取試劑。

圖4 不同提取試劑的影響Fig.4 Effects of different extraction reagents

圖5 不同化合物受提取試劑的影響（n=3）Fig.5 Effects of extraction reagents to different compounds(n=3)

2.2.3 凈化試劑的選擇

蔬菜中含有較多的天然色素，會(huì)隨著目標(biāo)化合物一起被提取，凈化處理可降低其對目標(biāo)化合物的干擾。QuEChERS 法中常用的凈化材料主要有PSA、C18、GCB和無水硫酸鎂等，四種試劑分別具有不同的凈化效果[22]，因此本研究考察了凈化試劑Ⅰ（無水硫酸鎂900 mg、PSA 150 mg）、凈化試劑Ⅱ（無水硫酸鎂900 mg、PSA 150 mg、GCB 15 mg）、凈化試劑Ⅲ（無水硫酸鎂1200 mg、PSA 400 mg、GCB 200 mg 和C18 400 mg）對芹菜的凈化效果，凈化后溶液顏色如圖6（見下頁）所示。

由圖6 可知，3 種凈化試劑包對目標(biāo)化合物的整體提取效果具有一定差異，其中回收率在70%～120%之間的化合物占總化合物個(gè)數(shù)的百分比分別為87.3%（凈化試劑Ⅰ）、76.9%（凈化試劑Ⅱ）和55.7%（凈化試劑Ⅲ），可能是由于GCB 不僅去除葉綠素和極性小分子干擾物的效果較好，對平面結(jié)構(gòu)的目標(biāo)化合物也有較強(qiáng)的吸附。

圖6 不同凈化試劑的凈化效果Fig.6 Effects of different purification reagents

如圖7 所示，拌種胺、涕滅威等12 種化合物回收率受凈化試劑包組成的影響較大，隨著凈化試劑中GCB 含量的增加，試劑的除雜效果越好，但嘧螨醚、嘧菌胺、呋菌胺和噻苯咪唑-5-羥基等10 種化合物的回收率顯著降低。綜合考慮回收率情況，本研究對于含色素、糖類及脂類較少的基質(zhì)選擇凈化試劑Ⅰ，對于含色素、糖類及脂類較多的樣品可選擇凈化試劑Ⅱ。

圖7 不同凈化試劑對回收率的影響（n=3）Fig.7 Recoveries of the different purification reagents (n=3)

2.3 方法學(xué)

2.3.1 線性范圍與檢出限

按1.4 節(jié)方法制備芹菜空白基質(zhì)溶液，用該溶液配制系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)曲線（5～300 μg/L），按1.5 節(jié)選定的儀器條件進(jìn)樣檢測，以各化合物的質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，定量離子色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，考察327 種農(nóng)藥的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，各目標(biāo)化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.995。采用空白樣品添加低質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液方式考察327 種農(nóng)藥的檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），檢出限范圍為0.5～15.0 μg/kg，定量限為1.0～30.0 μg/kg。

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

以空白芹菜為基質(zhì)，分別制備40、100、200 μg/kg 添加水平的加標(biāo)樣品，按1.4 節(jié)進(jìn)行前處理后進(jìn)行測定，以考察方法的準(zhǔn)確度（以加標(biāo)回收率表示）和精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）。由表1 可知，方法的準(zhǔn)確度為31.7%～133.0%，精密度為0.1%～14.8%，加標(biāo)回收率在80%～120%之間的化合物的百分比為78.4%。二氧威、二氯吡啶酸、苯醚氰菊酯、醚菊酯、吡蚜酮、噠螨靈、烯禾啶、喹螨醚、環(huán)嗪酮、氟胺氰菊酯和磺草靈11 種化合物的回收率均小于60%，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)其回收率穩(wěn)定在30%～55%之間。本方法對除上述11 種化合物外的316 種農(nóng)藥具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，可用于蔬菜中農(nóng)藥殘留的高通量快速篩查和確證，對于上述11 種回收率相對較低的化合物采用本方法可進(jìn)行快速定性篩查。

表1 327 種農(nóng)藥的保留時(shí)間（RT）、dMRM 參數(shù)、加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 1 Parameters of retention times (RT),dMRM,spiked recoveries and RSDs of the 327 pesticides (n=6)

續(xù)表

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2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是離子源中共存組分之間存在離子化競爭引起，可導(dǎo)致目標(biāo)離子的信號增強(qiáng)或抑制，可采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比表示，當(dāng)0.8≤ME≤1.2 時(shí)表示弱基質(zhì)效應(yīng)，可忽略不計(jì)；當(dāng)0.5≤ME＜0.8 或1.2＜ME≤1.5 時(shí)，表示中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＜0.5 或ME＞1.5 時(shí)表示強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)；ME＜100 時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME＞100 時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[23-24]?；|(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果顯示57.9%的化合物為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，42.1%的為抑制效應(yīng)；81.4%的農(nóng)藥具有弱基質(zhì)效應(yīng)，16.5%具有中等基質(zhì)效應(yīng)，僅氯草敏、苯醚甲環(huán)唑、氟蟲腈、磺草唑胺、磷酸三丁酯、嘧菌酯和噻吩磺隆具有強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)（占2.1%），其中氯草敏為抑制效應(yīng)，其余6個(gè)均為增強(qiáng)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，可降低基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)化合物的影響。

2.3.4 方法應(yīng)用

將建立的檢測方法應(yīng)用至豇豆基質(zhì)中：以空白豇豆為基質(zhì)，分別制備40、100、200 μg/kg 添加水平的加標(biāo)樣品，按1.4 節(jié)進(jìn)行前處理，在1.5 節(jié)條件對加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，分別考察327 種農(nóng)藥在豇豆基質(zhì)中的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限、準(zhǔn)確度、精密度及基質(zhì)效應(yīng)等。結(jié)果顯示，327 種農(nóng)藥在5～300 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均不小于0.991；檢出限范圍為0.5～15.0 μg/kg，定量限為1.0～30.0 μg/kg；327 種化合物回收率整體分布情況如圖8 所示。除丁酰肼、二氯吡啶酸、磺草靈、二氧威、吡喃靈和丁嗪草酮6 種回收率小于50%以外，其余321 種農(nóng)藥在3個(gè)加標(biāo)水平的回收率范圍分別為59.1%～139.0%（RSD范圍為0.5%～11.8%，40 μg/kg）、60.0%～130.0%（RSD范圍為0.4%～9.6%，100 μg/kg）和56.9%～119.5%（RSD范圍為0.2%～12.0%，200 μg/kg），丁酰肼、二氯吡啶酸、磺草靈、二氧威、吡喃靈和丁嗪草酮6 種農(nóng)藥的回收率穩(wěn)定在32.7%～56.5%之間，RSD%均小于9.2%。豇豆基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果顯示：52.0%的化合物為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，47.7%的為抑制效應(yīng)；73.7%的農(nóng)藥具有弱基質(zhì)效應(yīng)，19.6%具有中等基質(zhì)效應(yīng)，6.7%具有強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。

圖8 豇豆中回收率分布情況Fig.8 Distribution of recoveries in cowpea

3 方法驗(yàn)證

采用建立的方法對10 批經(jīng)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)或者食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法檢測為陽性的蔬菜進(jìn)行檢測，全部樣品均檢出農(nóng)藥，測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果一致，結(jié)果見表2。

表2 10 批樣品農(nóng)藥殘留的測定結(jié)果Table 2 Determination results of pesticide residues in 10 batches of samples

4 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式，建立了蔬菜中327 種農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測方法。通過線性、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限和實(shí)際樣品測定，驗(yàn)證了方法的可行性。該方法操作簡便、快速、靈敏度較高、準(zhǔn)確度和精密度均較好，適用于蔬菜中327 種農(nóng)藥殘留的高通量快速篩查和測定。