李家豪 謝芳 劉曉嵐

（1 湖南中醫(yī)藥大學 長沙 410208；2 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 長沙 410006；3 湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 長沙 410005）

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis, OA）是常見的退行性骨關(guān)節(jié)病，其發(fā)病與年齡、肥胖、性別、體質(zhì)量以及外傷等多種因素有關(guān)[1～3]。OA 的病變常累及整個關(guān)節(jié)，如滑膜增生、骨贅形成、軟骨下骨硬化，而進行性關(guān)節(jié)軟骨破壞和細胞外基質(zhì)合成代謝及分解代謝不平衡造成的軟骨流失是最主要的病理表現(xiàn)[4～5]。據(jù)統(tǒng)計，在OA 發(fā)病人群中，膝骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis, KOA）發(fā)病率高達45%，遠遠高于其他類型的 OA，故 KOA 是最主要的 OA 類型[6～7]。KOA 主要的臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)僵硬腫脹、關(guān)節(jié)周圍肌肉力量及功能下降[8～9]，是導致中老年人殘疾的主要原因之一[10]。有研究表明，KOA 影響著全球約2.5 億人的生活，每年帶來的醫(yī)療開支超過 891 億美元[11～12]，可見 KOA 不僅嚴重危害人類健康，還給社會經(jīng)濟造成巨大負擔。然而，由于KOA的發(fā)病機制非常復雜，到目前為止，臨床仍然缺乏治愈KOA 或完全阻止KOA 疾病發(fā)展的方法[13]。西醫(yī)從KOA 的病理特點出發(fā)，形成了以抗炎止痛、營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨及手術(shù)干預(yù)的系統(tǒng)治療方案，能在一定程度上緩解疼痛和改善膝關(guān)節(jié)活動度，但也存在遠期療效不佳、手術(shù)風險及后遺癥等不足之處[14]。中醫(yī)治療KOA 有獨特的認識，針對KOA 的發(fā)病特點及臨床癥狀表現(xiàn)形成了以補益肝腎、活血化瘀為代表的治療方法和理論體系。中醫(yī)藥治療KOA 臨床療效確切，在臨床中應(yīng)用廣泛，且患者的接受程度較高。

獨活與桑寄生是獨活寄生湯中的經(jīng)典藥對，廣泛應(yīng)用于肝腎不足型KOA 的治療。邵先舫教授以獨活寄生湯為基礎(chǔ)，結(jié)合自己臨床用藥經(jīng)驗創(chuàng)制的活膝湯在KOA 治療的臨床應(yīng)用中，療效優(yōu)良，其組方中也采用“獨活-桑寄生”藥對，配伍以奏祛風除濕、補益肝腎之效，協(xié)同發(fā)揮治療KOA 的作用。由于天然藥物調(diào)控機制的復雜性，“獨活與桑寄生”對KOA 的具體調(diào)控機制仍有待我們探索與研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學是在系統(tǒng)生物學的理論基礎(chǔ)上，利用數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析生物系統(tǒng)和藥物分子的新型學科[15]。2007年，李梢提出生物網(wǎng)絡(luò)與中藥方劑兩者相結(jié)合的觀點[16]，隨著醫(yī)學科學的日益發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學識別藥物中的化合物成分及靶點，能更準確合理地指導藥物在臨床治療中使用。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學成為了一種可以系統(tǒng)、有效揭示中醫(yī)藥方劑中分子作用機制的方法[17]。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)為依據(jù)，探討?yīng)毣钆c桑寄生的有效成分、潛在的作用機制及靶點，預(yù)測獨活與桑寄生干預(yù)KOA 的潛在靶點及作用機制，為“獨活-桑寄生”藥對防治KOA的進一步研究提供依據(jù)和借鑒?，F(xiàn)報道如下：

1 工具與方法

1.1 藥對的活性成分及作用靶點篩選 基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），檢索出獨活與桑寄生的藥物活性成分，篩選出類藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18，且口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%的活性成分，同時查找得到相應(yīng)的作用靶點。應(yīng)用Perl 插件刪除重復靶點，得到獨活-桑寄生藥對有效成分作用靶點。

1.2 KOA 作用靶點篩選 以“Knee Osteoarthritis”為檢索詞，在 GeneCards（https://www.genecards.org/）和 OMIM（https://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫中進行檢索，將條件設(shè)置為相關(guān)分數(shù)（Relevance Score）≥5 進行篩選，在 Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中查找到相應(yīng)的標準化疾病靶點。

1.3 藥物與KOA 的交集靶點篩選及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用R 軟件分析出藥物活性成分作用靶點與KOA 疾病靶點的交集，并以韋恩圖的方式呈現(xiàn)。將交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），蛋白種類的條件設(shè)置為“Homo Sapiens”，設(shè)置最低蛋白間互動分數(shù)的條件為0.7，構(gòu)建藥物活性成分-KOA 交集靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction,PPI），可得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并基于 R 軟件計算出獲得交集靶點出現(xiàn)的頻次。

1.4 藥物-成分-KOA 靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的靶點導入Cytoscape 3.7.1 軟件，制作出藥物-活性成分-KOA 靶點網(wǎng)絡(luò)圖。圖中每個節(jié)點代表不同的有效成分或共同作用靶點，每條連線代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的相互關(guān)系。

1.5 Gene Ontology 富集分析和 KEGG Pathway 富集分析 在 Bioconductor 數(shù)據(jù)庫（http://www.bioconductor.org/）中下載相關(guān)數(shù)據(jù)，應(yīng)用R 軟件對藥物與疾病共同作用靶點進行Gene Ontology（GO）富集分析和KEGG Pathway 富集分析，應(yīng)用Perl 插件對部分結(jié)果進行轉(zhuǎn)化。

1.6 分子對接 從PDB 數(shù)據(jù)庫中查找并下載核心靶點蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，應(yīng)用相應(yīng)軟件對靶點及活性成分進行處理，然而導入AutoDockTools 中進行分子對接，藥物分子與靶點的結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 則被認為具有較好的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 藥物有效成分與作用靶點 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索得到獨活藥物活性成分99 種，篩選后得到9種有效成分。桑寄生藥物活性成分46 種，篩選后得到2 種有效成分。獨活活性成分作用靶點151個，桑寄生活性成分作用靶點93個。應(yīng)用Perl 插件篩選并剔除重復部分得到獨活與桑寄生有效成分作用靶點151個。其中編號為MOL004782 的分子尚未發(fā)現(xiàn)作用靶點?！蔼毣?桑寄生”藥物有效成分與靶點數(shù)見表1。

表1 獨活-桑寄生藥物有效成分與靶點數(shù)

2.2 KOA 作用靶點篩選 以“Knee Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞，相關(guān)性分數(shù)≥5 為篩選條件，在GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中查找到KOA 的疾病靶點共為2 261個。

2.3 藥物-活性成分-KOA 交集靶點互作網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用R 軟件對比2 261個KOA 靶點與151個藥物有效成分作用靶點，篩選出94個共同作用靶點并畫出韋恩圖，得到的韋恩圖見圖1。采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建可視網(wǎng)絡(luò)圖，在藥物-有效成分-KOA 交集靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖中，共獲得96個節(jié)點和134 條邊。見圖2。藥對中各活性成分與KOA 疾病交集靶點的Degree 值見表2。

圖1 獨活-桑寄生活性成分靶點與KOA 疾病靶點韋恩圖

圖2 藥物-有效成分-KOA 交集靶點互作網(wǎng)絡(luò)

表2 藥物活性成分與KOA 交集靶點的Degree 值

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖 在STRING 數(shù)據(jù)庫輸入94個共同靶點，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。篩選出核心靶點，其中出現(xiàn)頻次較高的有 TNF、ILB、AKT1、TP53、MMP9、CASP3 等。見圖 4。

圖3 藥物-疾病交集靶點蛋白互作（PPI）圖

圖4 藥物-疾病交集靶點Degree 柱狀圖

2.5 GO 富集分析與KEGG 富集分析 對共同作用靶點進行分子功能GO 富集分析，共得到2 064 條生物學功能條目，42 條細胞組成條目和122 條分子功能條目，各組分排名前10 的條目見圖5。對共同作用靶點進行KEGG 生物途徑富集分析，總共有148個不同生物途徑，排名前30 的生物途徑見圖6。其中排名前5 的包括：脂質(zhì)與粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、白細胞介素-17 信號通路和腫瘤壞死因子信號通路?！蔼毣?桑寄生”干預(yù)KOA 的主要信號通路見圖7。

圖5 共同靶點GO 功能分析氣泡圖

圖6 KEGG 富集分析氣泡圖

圖7 “獨活-桑寄生”干預(yù)KOA 的主要信號通路

2.6 分子對接 將篩選到的核心靶點和“獨活-桑寄生”藥對中核心成分進行分子對接，結(jié)果表明該藥對的核心成分槲皮素可對核心靶點TNF、ILB 和AKT1 起作用，從而間接證實該藥對可通過調(diào)節(jié)TNF、ILB 和AKT1 靶點對KOA 起治療作用。見圖8。

圖8 “獨活-桑寄生”藥對核心靶點與KOA 的分子對接

3 討論

KOA 在中醫(yī)學中歸屬于“骨痹病”范疇。其發(fā)病通常與風寒濕邪侵襲、人體肝腎虧虛、瘀血阻絡(luò)有關(guān)?！端貑枴け哉撈吩疲骸帮L寒濕三氣雜至，合而為痹……骨痹不已，復感于邪，內(nèi)舍于腎?！蓖瑫r《素問·上古天真論》中曰：“七八肝氣衰，筋不能動。八八天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極。”可見，隨著年齡增加，肝腎虧虛，正體不足，邪毒就容易侵襲人體，從而發(fā)生痹病?！稄埵厢t(yī)通》：“膝者筋之府，膝痛無不因肝腎虧虛者，虛則風寒濕氣襲之。”《證治準繩》亦云：“膝痛有風，有寒，有閃挫，有瘀血，有痰積，皆實也，腎虛其本也”，肝腎虧虛是KOA 發(fā)生的主要內(nèi)因，風寒濕邪侵襲人體為外因。同時，也有一些醫(yī)家認為瘀血也是影響痹病的發(fā)病因素之一，《類證治裁·痹證》曰：“痹久必有瘀血”，《雜病源流犀燭》指出“痹者，閉也。三氣雜至，壅敝經(jīng)絡(luò)，血氣不行，不能隨時祛散，故久而為痹?！蓖跚迦卧凇夺t(yī)林改錯》中也提出“痹有瘀血”。由此可見本病肝腎虧虛是基礎(chǔ)，氣血瘀滯是關(guān)鍵，兼夾外感邪氣，屬于本虛標實證，治療當以補腎活血為主，輔以祛風散寒除濕[18]。

獨活歸屬腎、膀胱經(jīng)，祛風除濕、宣痹止痛；桑寄生歸屬肝、腎經(jīng)，補益肝腎、強筋壯骨?！蔼毣?桑寄生”常配伍用于補益肝腎、祛風除濕，是經(jīng)典方獨活寄生湯中的藥對。在KOA 治療的中藥用藥規(guī)律分析中發(fā)現(xiàn)，這兩味藥在治療KOA 的臨床組方中應(yīng)用較為廣泛?，F(xiàn)代藥理學研究表明獨活乙醇提取物能夠抑制環(huán)氧化酶-1 及環(huán)氧化酶-2，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛效果[19]。桑寄生具有祛風濕、補肝腎、強筋骨的作用，其祛風濕的作用可能與免疫抑制有關(guān)[20]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)對“獨活-桑寄生”藥對干預(yù)KOA 的作用機制作了初步的數(shù)據(jù)挖掘。研究結(jié)果顯示“獨活-桑寄生”有效成分11 種，藥物有效成分已知的作用靶點151個，其中干預(yù)KOA 的潛在靶點 94個。最受關(guān)注的是槲皮素（quercetin，MOL000098），作用靶點多達 148個，其中與 KOA 相關(guān)的靶點多達88個。研究表明，槲皮素是一類雙黃酮類化合物，具有多種藥理作用，包括抗氧化、神經(jīng)保護、抗病毒、抗癌、抗菌、抗炎、保肝、抗肥胖等[21～22]。在OA 的發(fā)展過程中，槲皮素能降低TNF-α、MMP3、MMP9、CCL2 的表達，在抗炎的同時抑制軟骨細胞外基質(zhì)的降解[23]。湯喜蘭等[24]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對TNF-α、IL-6、IL-1β 的負性調(diào)節(jié)作用可能是通過抑制NF-κB 信號通路的激活完成?？梢?，槲皮素可能是“獨活-桑寄生”作用于KOA 的關(guān)鍵活性成分之一。同時，β-谷甾醇和谷甾醇也具有抗炎、抗氧化等作用，其對KOA 的治療作用也屢見報道。

“獨活-桑寄生”與KOA 共同作用靶點PPI 映射及分析得到出現(xiàn)頻次較多的靶點，如TNF、ILB、AKT1、TP53、MMP9、CASP3 等，這些可能是“獨活 -桑寄生”治療KOA 的潛在作用靶點。TNF 是一種常見的炎性細胞因子，在KOA 發(fā)病中有重要作用，中老年患者KOA 越嚴重則關(guān)節(jié)液中TNF-α 的含量水平越高[25]，通過降低關(guān)節(jié)中TNF-α 的含量能減輕關(guān)節(jié)炎癥，保護關(guān)節(jié)軟骨，從而延緩KOA 的病情進展[26]。同時，IL-1β 屬于白細胞介素分子家族，主要與炎癥反應(yīng)有關(guān)，下調(diào)IL-1β 表達能有效抑制相關(guān)炎癥反應(yīng)[27～28]。MMP9 屬于金屬基質(zhì)蛋白酶家族，主導軟骨細胞外基質(zhì)的降解，常常與IL6、TNF-α 等致炎因子協(xié)同促進關(guān)節(jié)軟骨的破壞[29]。此外，AKT1 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究顯示AKT1 與細胞凋亡有關(guān)，抑制AKT1 的表達能促進軟骨細胞的凋亡[30～31]。

GO 富集分析與KEGG 富集分析結(jié)果顯示，上述共同作用靶點參與的生物活動主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及對細菌源性分子的反應(yīng)等，并大多富集于脂質(zhì)與粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、白細胞介素-17 信號通路和腫瘤壞死因子信號通路。 晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycosylation End Products, AGE） 及 其 受 體（Receptor of AGE,RAGE）的作用機制尚未完全明確。目前研究顯示AGE 主要在糖尿病患者體內(nèi)高表達[32]，AGE-RAGE 能激活下游 NF-κB 信號通路，促進 IL-6、IL-8、TNF-α 等致炎因子的表達，激活的NF-κB 又能增加RAGE 的表達，形成正向的反饋調(diào)節(jié)[33]。除此之外，AGE-RAGE 還與 VEGF 的表達正相關(guān)，阻斷AGE-RAGE 的激活能抑制VEGF 的表達[34]。目前關(guān)于AGE-RAGE 信號通路的研究主要集中在糖尿病及心血管疾病方面，涉及OA 的研究較少。本研究KEGG 富集結(jié)果提示“獨活-桑寄生”干預(yù)KOA 的作用靶點與AGE-RAGE 信號通路高度相關(guān)，這為研究KOA 的發(fā)病機制提供了新的思路。而IL-17 和TNF 信號通路與KOA 的發(fā)病及病情進展密切相關(guān)，分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“獨活-桑寄生”藥對中槲皮素能調(diào)節(jié) ILB、TNF 和 AKT1 對 KOA 起治療作用，間接證實了該藥對具有調(diào)節(jié)ILB、TNF 和AKT1 靶點治療KOA 的潛在作用，但該分子機制仍需實驗進一步驗證。

綜上所述，“獨活-桑寄生”中11個有效成分，調(diào)控 IL6、TNF、AKT1 等 94個靶點，主要通過AGE-RAGE、TNF 和ILB 等信號通路干預(yù)KOA。本研究采用中藥藥理學分析，預(yù)測出“獨活-桑寄生”藥對治療KOA 的潛在作用機制，為進一步研究該藥治療KOA 的分子機制提供依據(jù)。同時，有利于進一步明確中藥復雜成分的主要活性成分及作用機理，為該藥對在KOA 的臨床治療中應(yīng)用提供證據(jù)。