張蕊，張琪，桑躍，張永祥，胡雅倩，齡南

（1.中國農(nóng)業(yè)大學營養(yǎng)與健康系，北京 100190；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，蘭州730070；3.南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司，南京 211102）

產(chǎn)丁酸細菌作為一類重要的腸道細菌，近年來引起許多研究者的關(guān)注[1]。據(jù)研究，人體內(nèi)超過95%的丁酸在結(jié)腸內(nèi)產(chǎn)生和吸收[2]，其能夠使結(jié)腸細胞保持穩(wěn)定[3]，可以調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)和治療腸易激綜合征、抗生素相關(guān)性腸炎、急慢性腹瀉等疾病[4]。

乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一類可利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸的細菌的統(tǒng)稱，其發(fā)酵可以產(chǎn)生乳酸、乙酸、雙乙酰和丁酸等物質(zhì)[5]。人體內(nèi)的丁酸主要通過乳酸菌利用乳糖產(chǎn)生丙酮酸，在丁酰磷酸轉(zhuǎn)移酶和丁酸激酶的作用下生成[6]。近年來研究表明，丁酸激酶可能是丁酸形成過程中的主要酶[7]。目前，多數(shù)研究都針對腸道菌群產(chǎn)丁酸的作用及機制[8]，進行乳酸菌產(chǎn)丁酸機制的研究。

本文采用PCR擴增目的基因的方法，從40株乳酸菌中篩選具有丁酸激酶的乳酸菌，并檢測其發(fā)酵液中丁酸產(chǎn)量，進一步利用動物實驗探究其對小鼠免疫功能的影響，為菌株的產(chǎn)品開發(fā)和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

40株實驗菌株來自中國農(nóng)業(yè)大學益生菌研究中心；健康的6～8周BALB/c雄性小鼠，18～22g：購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗儀器

基因擴增儀（德國Eppendorf AG）；HF90型CO2培養(yǎng)箱（美國NAPCO）；GC-8860氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；M 200 PRO多功能酶標儀（瑞士Tecan）；DL-CJ-2ND1潔凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；HV-110高壓滅菌鍋（日本Hirayama）。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌種活化

無菌條件下，乳酸菌凍干粉菌種，接種于10mL脫脂乳中，充分振蕩后，37℃靜置培養(yǎng)，凝固后以5%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)傳代。傳代3次后，取第3代菌液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增丁酸激酶

細菌試劑盒提取DNA，以引物F（5’-GCTCGCTCGTATCAGTGGTT-3’）、R（5’-CCATTTCTCCTGGTCGCACT-3’）進行PCR擴增。

PCR反應體系（25μL）：模板DNA1μL、上下游引物各1μL、Taq Mix 12.5μL、無菌水9.5μL。PCR反應程序：94℃預變性3min、94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min、72℃保持5min，30個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物。

1.3.3 氣相色譜測定丁酸產(chǎn)量

菌種活化完成后，在無菌條件下，按照5%的接種量接于MRS培養(yǎng)基中，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h、18h、24h，取發(fā)酵液20μL，用50%硫酸和乙醚提取丁酸，以2-乙基丁酸為內(nèi)標，進行氣相色譜儀測定。

色譜條件：柱流量為1mL/min，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度為250℃，進樣量為1μL；升溫程序如下：60℃保持4min，以6℃/min的速度升溫至180℃，再以20℃/min的速度升溫至200℃，保持5min。

1.3.4 實驗動物分組

小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分成3組，空白對照組、乳酸菌（L-113）低劑量組（1×107CFU/只）和乳酸菌（L-113）高劑量組（1×109CFU/只），每組8只。試驗組以設(shè)定菌液濃度連續(xù)灌胃45d。

1.3.5 動物免疫功能測定

1.3.5.1 脾淋巴轉(zhuǎn)化實驗

頸椎脫臼法處死小鼠，無菌取脾，制成濃度為1×106個/mL的脾細胞懸液。進行MTT試劑盒測定，酶標儀于450nm處測定吸光值。脾淋巴轉(zhuǎn)化能力以加ConA（刀豆蛋白）孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值表示。

1.3.5.2 遲發(fā)型變態(tài)反應（DHT）

灌胃結(jié)束后，用2%綿羊紅細胞（Sheep red blood cell,SRBC）對小鼠進行腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL（約1×108個SRBC），4d后，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20%SRBC，每只鼠20μL（約1×108個SRBC），24h后用游標卡尺測量左后足跖部厚度或腫脹度，同一部位測量三次，取平均值。

1.3.5.3 抗體生成細胞檢測

灌胃結(jié)束后，用2% SRBC對小鼠進行腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL（約1×108個SRBC），4d后，無菌取脾，制成濃度為5×106個/mL的脾細胞懸液。在50℃恒溫試管中加入0.5mL/管的Hank，SA液（含0.5%瓊脂糖）備用。試管中加入25μL脾細胞懸液和50μL 10%SRBC，混勻，37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，用SA緩沖液稀釋補體，室溫孵育4h，統(tǒng)計軟件統(tǒng)計每孔溶血空斑數(shù)，以空斑數(shù)/106脾細胞表示。

1.3.6 血清溶血素的測定

灌胃結(jié)束后，注射2% SRBC對小鼠進行免疫，0.2mL/只，4d后，眼眶采血制備血清，試管中加入1mL用SA緩沖液稀釋200倍后的血清，依次加入SRBC和補體。對照組試管中的血清以SA液代替。37℃水浴20min，離心10min（2000r/min），取上清液加入都氏試劑，對照空白中加10% SRBC和都氏試劑，混勻后在540nm處測定吸光度值。

血清溶血素HC50=（樣品吸光度/SRBC半數(shù)溶血時吸光度）×200

1.3.7 NK細胞活性測定

用含10%胎牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整脾細胞濃度為1×106個/mL做效應細胞備用；以YAC-1細胞作為靶細胞，將已傳代的靶細胞用含10%胎牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×104個/mL做靶細胞備用；效應細胞與靶細胞各100μL共同培養(yǎng)，WST-8試劑盒檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 丁酸激酶的PCR擴增

丁酸激酶目的片段在600bp左右，對40株乳酸菌進行PCR擴增，將擴增后的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一株含有目的基因的副干酪乳桿菌L-113。結(jié)果如圖1所示。

圖1 目的基因檢測電泳圖

2.2 丁酸產(chǎn)量的測定

將L-113接入MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵，分別取12h、18h、24h發(fā)酵液用GC測定其丁酸產(chǎn)量，結(jié)果如圖2所示，可以看出隨著發(fā)酵時間的增加，丁酸產(chǎn)量呈上升趨勢，發(fā)酵24h時，丁酸產(chǎn)量最高，可達5.8g/L。高文文等的研究發(fā)現(xiàn)一株高產(chǎn)丁酸的丁酸梭菌24h發(fā)酵液中丁酸含量為2.1g/L左右[9]，L-113丁酸產(chǎn)量約是它的3倍。

圖2 L-113丁酸產(chǎn)量圖

2.3 動物免疫功能測定

2.3.1 脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化

ConA刺激脾淋巴細胞中的T細胞增殖，增殖程度反映了T細胞的活性，是重要的細胞免疫指標。脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化結(jié)果見圖3。灌胃低劑量與高劑量L-113的小鼠脾淋巴細胞增值能力均高于對照組，其中L-113高劑量組與對照組差異顯著。而L-113低劑量組小鼠脾淋巴細胞增殖能力雖高于對照組，但無顯著差異。

圖3 小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.3.2 遲發(fā)型變態(tài)反應

SRBC刺激T淋巴細胞成致敏淋巴細胞，4d后再以SRBC攻擊時，攻擊部位出現(xiàn)腫脹，腫脹程度反應遲發(fā)型變態(tài)反應程度，是細胞免疫功能的重要測定指標。經(jīng)SRBC攻擊前后小鼠足趾厚度差見圖4。圖中顯示，兩個劑量組小鼠足跖變態(tài)反應均高于對照組，L-113低劑量組、高劑量組與對照組之間均有顯著差異。

圖4 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應實驗結(jié)果

2.3.3 抗體生成細胞檢測

由B細胞介導的體液免疫是評價機體調(diào)節(jié)免疫能力的重要組成部分，抗體生成細胞是體液免疫能力檢測重要的指標之一。用SRBC免疫動物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素），利用其凝集SRBC的程度來檢測溶血素的水平。

如圖5所示，L-113低劑量組與高劑量組的抗體生成細胞數(shù)顯著高于對照組，說明L-113能增加抗體生成細胞數(shù)含量。

圖5 抗體生成細胞檢測

2.4 血清溶血素測定

用SRBC免疫動物后產(chǎn)生溶血素，其含量表示血清中產(chǎn)生抗體的能力，反映動物的免疫能力。如圖6所示，與對照組相比，低、高劑量干預組小鼠的HC50值有上升趨勢但無顯著差異，表明灌胃L-113的小鼠產(chǎn)生抗體的能力沒有顯著升高。

圖6 血清溶血素測定

2.5 NK細胞測定

NK細胞是沒有T和B細胞表面標志的淋巴細胞，具有非特異性殺傷作用，其增殖情況能反映動物的免疫能力。由圖7可知，灌胃L-113兩個劑量組的小鼠NK細胞活性均高于對照組，且兩個劑量組均與對照組有顯著差異，表明L-113具有增強NK細胞活性的能力。

圖7 NK細胞活性測定

3 結(jié)論

丁酸激酶作為丁酸產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵酶，其調(diào)控基因起到了重要作用，因此本試驗以PCR擴增丁酸激酶基因片段作為篩選高產(chǎn)丁酸的乳酸菌的方法，篩選的40株乳酸菌中有一株副干酪乳桿菌L-113在600pb左右得到特異性目的條帶。L-113在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵24h后的丁酸產(chǎn)量為5.8g/L。動物實驗結(jié)果顯示，灌胃L-113能顯著增強細胞免疫（包括脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力和遲發(fā)型變態(tài)反應）、體液免疫（包括抗體生成能力）、NK細胞活性等免疫功能。本研究可為菌株在功能性產(chǎn)品中的應用提供理論依據(jù)。