高 向 紅， 王 從 綱， 龐 焦， 李 憲 臻

(大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

異麥芽酮糖(α-D-吡喃葡糖基-1，6-D-果糖)是一種具有保健作用的新型功能糖，作為添加劑廣泛應用于保健品、糖尿病人食品和運動飲料中，越發(fā)受到消費者的歡迎[1-3]。天然異麥芽酮糖主要存在于蜂蜜、甘蔗汁中，含量較低，且難以用化學方法合成。目前主要采用蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖，再經(jīng)過濃縮和結(jié)晶等步驟獲得異麥芽酮糖[3-5]。

現(xiàn)有蔗糖異構(gòu)酶生產(chǎn)菌普遍產(chǎn)酶水平低，因此研究人員主要將蔗糖異構(gòu)酶固載于水不溶性載體上，如以硅藻土為介質(zhì)進行吸附固載[6]，利用海藻酸鈉-羧甲基纖維素鈉進行混合包埋，利用殼聚糖-戊二醛吸附交聯(lián)、制備交聯(lián)酶聚集體等手段將蔗糖異構(gòu)酶制備成固定化酶[7]，以從反應體系中分離回收和再利用，從而降低異麥芽酮糖的生產(chǎn)成本。然而，制備固定化酶需要利用色譜法分離純化大量可溶酶，并且需要載體材料和固定化反應相關(guān)的化學試劑，這些過程增加了生產(chǎn)成本，阻礙了固定化蔗糖異構(gòu)酶的規(guī)?；a(chǎn)和應用。近年研究發(fā)現(xiàn)，將一些具有聚集特性的短肽或蛋白與可溶酶融合表達，可以誘導其在表達宿主細胞中形成具有催化活性的包涵體(CatIBs，簡稱活性包涵體)[8-11]。目前，β-半乳糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶、丙酮酸氧化酶、脂肪酶等被成功表達為活性包涵體[8]。相比傳統(tǒng)的酶固定化方法，將酶蛋白制備成活性包涵體具有諸多優(yōu)勢，如表達和固定化同時進行、不需要額外的載體材料和固定化反應、表達量大、容易分離純化、生產(chǎn)過程中不容易被降解等。因此，活性包涵體作為一種新型酶異源表達和固定化策略，具有良好的工業(yè)應用前景[8-9]。

源于釀酒酵母的氮代謝調(diào)控蛋白Ure2是目前常用于蛋白質(zhì)聚集機制研究的安全模式蛋白，導致其發(fā)生聚集的關(guān)鍵片段是其N端1～90位氨基酸序列，富含Asn和Gln[12-14]。本實驗將Ure2蛋白N端聚集序列作為標簽，與蔗糖異構(gòu)酶融合表達，制備淀粉樣融合蔗糖異構(gòu)酶活性包涵體，并進行酶學性質(zhì)表征，以期為工業(yè)化應用固定化蔗糖異構(gòu)酶提供一種高效低成本的新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔗糖異構(gòu)酶SIase(NCBI序列號：AAK82938)源于Klebsiellasp.LX3，攜帶其基因的質(zhì)粒pET 28a-SIase為大連工業(yè)大學微生物資源與生物催化實驗室保藏；大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)，獲贈于中科院大連化學物理研究所趙宗保研究員課題組；pET 28a-Ure2N-linker，生工生物工程(上海)股份有限公司；Protein Marker(High)、250 bp DNA Marker、限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和XhoI、T4 DNA連接酶；DNA膠回收試劑盒、IPTG、卡那霉素、胰蛋白胨、酵母粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；3，5-二硝基水楊酸，國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖，科密歐化學試劑有限公司。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同LB液體培養(yǎng)基。

JY92-IIN超聲破碎儀，寧波新芝生物技術(shù)有限公司；UV5200紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；MD spectramax paradigm酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；5804R型離心機，美國Eppendorf公司；高效液相色譜分析儀，美國安捷倫科技公司。

1.2 方 法

1.2.1 pET 28a-Ure2N-linker-SIase表達載體的構(gòu)建

將pET 28a-Ure2N-linker和pET 28a-SIase分別用BamH I和XhoI進行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用DNA膠回收試劑盒回收線性化載體質(zhì)粒和目的基因片段，繼續(xù)用T4 DNA連接酶進行連接，之后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，涂布于終質(zhì)量濃度50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板上。挑取單菌落進行菌落PCR驗證，將陽性轉(zhuǎn)化子進一步培養(yǎng)提取質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證后，送吉林庫美生物科技有限公司測序。

1.2.2 Ure2N-linker-SIase和SIase的異源表達

將重組質(zhì)粒pET 28a-Ure2N-linker-SIase和pET 28a-SIase分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，挑取陽性克隆于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)14 h得到種子液。將種子液按體積比1∶50轉(zhuǎn)入含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)在16 ℃、200 r/min下培養(yǎng)20 h進行誘導表達。8 000 r/min、4 ℃離心收集菌體細胞，用含終體積分數(shù)5%甘油、pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液重懸后超聲破碎，10 000 r/min、4 ℃離心分別得到上清和沉淀。

1.2.3 活性包涵體酶液的制備

轉(zhuǎn)化菌體經(jīng)超聲破碎離心收集的沉淀依次用含有終體積分數(shù)5%甘油、0.5% Triton X-100重懸、pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液和含有終體積分數(shù)5%甘油、pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液重懸清洗2次和3次，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清液收集包涵體沉淀。將清洗后的包涵體用pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液重懸獲得包涵體酶液。取少量包涵體酶液加入等體積10% SDS溶液處理5 min溶解包涵體，之后利用BCA法測定蛋白濃度。將上清液和清洗后的包涵體樣品利用SDS-PAGE進行檢測。

1.2.4 TLC法分析活性包涵體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

TLC展開劑：正丁醇100 mL、乙醇60 mL、水40 mL混勻。顯色劑：取二苯胺0.2 g溶于10 mL 丙酮，再加入苯胺200 μL和85%磷酸1 mL。將果糖、葡萄糖、蔗糖、異麥芽酮糖標準品，以及活性包涵體轉(zhuǎn)化蔗糖反應產(chǎn)物和對照組分別取2 μL點樣，85 ℃烘板后進行分析。

1.2.5 HPLC法檢測活性包涵體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

將轉(zhuǎn)化后的樣品煮沸15 min進行滅酶處理，在10 000 r/min離心10 min，取上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC檢測。HPLC色譜條件：色譜分離柱，Hypersil APS-2，4.6 mm×250 mm；示差檢測器，5 μm氨基柱；流動相，體積比 80∶20 的乙腈-水溶液；進樣量，10 μL；體積流量，1.0 mL/min；柱溫，35 ℃。

1.2.6 活性包涵體的酶活測定

反應體系：取100 μL 4 mg/mL的活性包涵體酶液與400 μL含4%蔗糖的磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液混勻，45 ℃、200 r/min反應2 h，使用DNS法測定還原糖并計算酶活力。酶活力單位定義：以蔗糖為底物，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活力單位(U)。相對酶活定義：以同組測定的最高酶活力為100%，計算所得比值為相對酶活。

1.2.7 活性包涵體的酶學性質(zhì)測定

1.2.7.1 最適反應溫度

將活性包涵體酶液于pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃條件下測定酶活力，確定最適反應溫度。

1.2.7.2 最適反應pH

將活性包涵體分別溶解在pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和4%蔗糖的磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液中，于45 ℃下測定酶活力，確定最適反應pH。

1.2.7.3 酶動力學常數(shù)

分別以10、20、50、100、200、250、500 mmol/L的蔗糖為底物，在45 ℃、pH 6.0條件下測定活性包涵體的酶活力?；钚园w質(zhì)量濃度4 mg/mL，反應時間為15 min。利用GraphPad Prism 5.0基于Michaelis-Menten方程進行非線性擬合，得到動力學常數(shù)Km和Vmax，計算得到kcat/Km。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達載體的構(gòu)建和驗證

將經(jīng)過BamH I和XhoI雙酶切的表達載體pET 28a-Ure2N-linker與目的基因SIase進行連接和轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，利用含有卡那霉素的平板進行篩選，挑取單菌落作為模板，利用針對pET 28a載體的T7通用引物進行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物在2 250～3 000 bp處存在單一條帶，與預期條帶2 339 bp位置相符，表明其為陽性克隆。

M，DNA Marker；1，重組質(zhì)粒構(gòu)建菌落PCR鑒定結(jié)果

將鑒定正確的菌落進行液體培養(yǎng)和提取質(zhì)粒，用BamH I和XhoI進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖2所示，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后在1 500～2 250 bp和大于4 500 bp處產(chǎn)生兩條特異性條帶，與預期結(jié)果1 797和5 593 bp相符。將驗證正確的重組質(zhì)粒進行測序驗證，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET 28a-Ure2N-linker-SIase構(gòu)建成功。

M，DNA Marker；1，酶切條帶

2.2 重組蛋白的異源表達

分別將重組質(zhì)粒pET 28a-SIase和pET 28a-Ure2N-linker-SIase轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，再利用IPTG進行誘導表達，菌體細胞超聲破碎后通過離心分離上清液和不溶性沉淀，利用SDS-PAGE進行檢測，結(jié)果如圖3和圖4所示。SIase和Ure2N-linker-SIase在理論分子質(zhì)量大小處存在目的條帶，其中SIase主要以可溶性形式表達，而融合蛋白Ure2N-linker-SIase主要以包涵體形式存在于沉淀中，表明融合淀粉樣蛋白Ure2N誘導SIase形成了包涵體。

M，蛋白Marker；1，轉(zhuǎn)化空載體誘導后樣品(對照)；2～5，轉(zhuǎn)化pET 28a-SIase誘導前、誘導后、上清液、沉淀樣品

M，蛋白Marker；1～4，轉(zhuǎn)化pET 28a-Ure2N-linker-SIase誘導前、誘導后、上清液、沉淀樣品

將Ure2N-linker-SIase包涵體經(jīng)過緩沖液清洗后重懸于pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液制備成包涵體酶液并與底物蔗糖溶液混合進行轉(zhuǎn)化，反應產(chǎn)物采用TLC和HPLC進行檢測。結(jié)果如圖5和圖6所示。從圖5可以看出，包涵體酶液可以催化蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖。從圖6可以看出，包涵體酶液轉(zhuǎn)化底物蔗糖的反應產(chǎn)物以異麥芽酮糖為主，伴有海藻酮糖、果糖和葡萄糖，與已報道不同來源蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖的反應產(chǎn)物組成類型相同[4]，表明Ure2N-linker-SIase在大腸桿菌中以活性包涵體形式表達，證明了利用淀粉樣蛋白Ure2N作為融合標簽誘導蔗糖異構(gòu)酶形成活性包涵體的可行性。

1～4，分別為果糖、葡萄糖、蔗糖、異麥芽酮糖標準品；5，Ure2N-linker-SIase活性包涵體轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；6，對照組產(chǎn)物

(a)滅活前

通過酶固定化能夠?qū)⒄崽钱悩?gòu)酶從反應體系中回收，提高利用率。目前主要采用吸附法和交聯(lián)法等傳統(tǒng)方法制備蔗糖異構(gòu)酶固定化酶[6-7]，需要載體材料和固定化反應所需化學試劑。本研究成功制備出蔗糖異構(gòu)酶活性包涵體，實現(xiàn)其表達和固定化同步進行，不需要額外的載體材料和固定化反應，不僅簡化了分離步驟，而且降低了固定化酶的制備成本，具有潛在的應用價值。

2.3 活性包涵體的酶學性質(zhì)表征

進一步對Ure2N-linker-SIase活性包涵體的溫度和pH適應范圍進行了檢測，結(jié)果如圖7和圖8所示。從圖7可以看出，活性包涵體在35～45 ℃范圍內(nèi)具有最高酶活力。當溫度超過55 ℃時，酶活力開始迅速下降。從圖8可以看出，活性包涵體在pH 5.0～6.5的相對酶活力超過82%，在pH 6.0時酶活力最高。而課題組前期工作顯示[15]，可溶表達的蔗糖異構(gòu)酶最適溫度為35 ℃，最適pH為6.0，因此蔗糖異構(gòu)酶以活性包涵體形式表達并未顯著改變其最適溫度和最適pH。

圖7 溫度對Ure2N-linker-SIase酶活力的影響

圖8 pH對Ure2N-linker-SIase酶活力的影響

在最適條件下測定了活性包涵體的動力學常數(shù)，其對蔗糖底物的Km為(105.4±23.4)mmol/L，kcat/Km為(3.1±0.4)L/(mmol·min)，而課題組前期工作檢測到可溶表達的蔗糖異構(gòu)酶對蔗糖底物的Km為(54.6±1.7)mmol/L，kcat/Km為(0.27±0.02)L/(mmol·min)，表明蔗糖異構(gòu)酶以活性包涵體表達降低其對底物蔗糖的親和力，但催化效率明顯提高[15]。

2.4 活性包涵體的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組成分析

采用HPLC檢測了不同溫度下活性包涵體轉(zhuǎn)化蔗糖的反應產(chǎn)物中不同糖組分的含量，計算產(chǎn)物中各組分質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果如表1所示。在30～40 ℃，隨著溫度升高，異麥芽酮糖質(zhì)量分數(shù)提高，海藻酮糖質(zhì)量分數(shù)降低，同時單糖(果糖和葡萄糖)的質(zhì)量分數(shù)提高。結(jié)果表明，蔗糖異構(gòu)酶活性包涵體與文獻[15-16]報道的來源于Klebsiellasp.LX3、KlebsiellapneumoniaeNK33-98-8等蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化反應的特征類似，即在30～40 ℃，提高反應溫度有利于異麥芽酮糖生成，減少海藻酮糖的生成，同時增加單糖的形成。盡管提高溫度有利于異麥芽酮糖的生成，但反應產(chǎn)物中同時增加的單糖需采用糖分離技術(shù)除去，會導致生產(chǎn)成本的提高，而對蔗糖異構(gòu)酶進行分子改造以獲得不形成非異麥芽酮糖產(chǎn)物的新型蔗糖異構(gòu)酶是當前研究工作的重點，研究已發(fā)現(xiàn)蔗糖異構(gòu)酶中存在通過協(xié)同作用影響其產(chǎn)物特異性的多個調(diào)控區(qū)域[4]。由于目前對活性包涵體的結(jié)構(gòu)和形成機制研究剛剛起步，未來的研究工作需要開發(fā)先進技術(shù)手段解析活性包涵體形成和催化反應的分子基礎(chǔ)，進一步指導分子設(shè)計和改性以制備高純異麥芽酮糖。

表1 活性包涵體催化反應的產(chǎn)物組成分析

3 結(jié) 論

以Ure2N為融合標簽，構(gòu)建表達載體pET 28a-Ure2N-linker-SIase，在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達了蔗糖異構(gòu)酶的活性包涵體形式，并采用TLC和HPLC對其酶學性質(zhì)和產(chǎn)物組成進行了檢測分析，Ure2N-linker-SIase活性包涵體在35～45 ℃、pH 5.0～6.5具有較高的相對酶活力，最適反應溫度pH分別為35 ℃和pH 6.0，動力學常數(shù)Km為(105.4±23.4)mmol/L，kcat/Km為(3.1±0.4)L/(mmol·min)。

本研究是在分子水平對蔗糖異構(gòu)酶進行改造以提高其分離性能和利用率的新嘗試，同時活性包涵體作為一種新型固定化酶，不需要傳統(tǒng)酶固定化所需的載體材料和固定化反應所需化學試劑，具有潛在的工業(yè)應用價值。由于不同融合標簽和N/C端融合位置影響活性包涵體的表達量和酶活力[11]，因此本研究為制備高表達水平、高活性蔗糖異構(gòu)酶活性包涵體的進一步分子設(shè)計和優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。