陳夢(mèng)飛，王 穎，白 雪，楊麗婷，張 玲

隨著肺部感染等疾病不斷增加，膿毒癥在急診救助過程中發(fā)生率逐年升高[1]。由于機(jī)體全身嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等多種原因所導(dǎo)致全身的炎性反應(yīng)，其炎癥狀態(tài)與預(yù)后存在明顯的關(guān)聯(lián)性，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB在調(diào)節(jié)多種免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)的表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展[2]，因此，開發(fā)專門針對(duì)NF-κB通路的新療法對(duì)改善嚴(yán)重膿毒癥患者的高死亡率至關(guān)重要。白細(xì)胞介素-4(IL-4)是抑制炎癥的細(xì)胞因子，膿毒癥中IL-4的分泌可能會(huì)限制并最終終止炎癥反應(yīng)，可調(diào)節(jié)過量的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的免疫宿主反應(yīng)，是抑制炎癥發(fā)展的重要炎癥介質(zhì)[3]。本研究通過構(gòu)建膿毒癥肺損傷模型，探討外源性IL-4對(duì)新生小鼠膿毒癥肺損傷的潛在保護(hù)作用，并試圖闡明其可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：雄性C57BL/6小鼠30只，8～10周齡，體重18～22 g，來自國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(北京，中國(guó))，以正常食物和自來水喂養(yǎng)，并在24 ℃、12 h光照和12 h暗循環(huán)條件下培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 體外模型構(gòu)建： MH-S細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力： 將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞，24 h后加入終濃度為10、20 ng/mL的外源性IL-4，培養(yǎng)24 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于450 nm處測(cè)定各孔吸光度值。

1.2.1.2 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平： 將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約1×105個(gè)細(xì)胞，接種24 h后，將細(xì)胞分為4組，即空白對(duì)照組、模型組(只加LPS溶液)、實(shí)驗(yàn)組1(LPS+10 ng/mL的IL-4)、實(shí)驗(yàn)組2(LPS+20 ng/mL的IL-4)。除空白對(duì)照組外，每組加入終濃度為1.0 μg/mL的LPS溶液，培養(yǎng)2 h后實(shí)驗(yàn)組加入外源性IL-4，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次,然后每組加入細(xì)胞裂解液80～150 μl，裂解后離心取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。使用10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBST清洗(5次，5 min/次)，一抗4 ℃孵育過夜；PBST清洗，加入二抗孵育1 h，PBS清洗后進(jìn)行曝光。采用Image J軟件分析電泳條帶灰度值。

1.2.1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約1×105個(gè)細(xì)胞。接種24 h后將細(xì)胞分為3組，即空白對(duì)照組(A組)、模型組(B組，只加LPS溶液)、實(shí)驗(yàn)組(C組，LPS+20 ng/mL的IL-4)。除空白對(duì)照組外，每組加入終濃度為1.0 μg/mL的LPS溶液，待培養(yǎng)2 h后，實(shí)驗(yàn)組加入外源性IL-4，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取上清液。按照Elish相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，分別計(jì)算TNF-α、IL- 6、IL-1β的含量。

1.2.1.4 活性氧水平檢測(cè)：按照1.2.2中方法進(jìn)行細(xì)胞的接種及給藥。給藥24 h后加入DCFH-DA探針，繼續(xù)培養(yǎng)40 min后使用倒置熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)。

1.2.2 體內(nèi)模型構(gòu)建：采用LPS構(gòu)建膿毒癥肺損傷模型。小鼠采用濃度為0.5%的戊巴比妥鈉溶液220 μl進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉充分后取仰臥位，固定小鼠頭部與四肢。剪凈頸部毛發(fā)，使用75%酒精消毒皮膚2次后，在頸部正中切開3～4 mm，鈍性分離頸部腺體、肌肉等組織，暴露氣管。A、B組小鼠使用1 mL注射器以45°角經(jīng)氣管軟骨環(huán)注射50 μl的LPS溶液(根據(jù)小鼠體重，濃度為15 mg/kg)入氣管，C組小鼠注射同等劑量磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)。注射后使小鼠頭部向上與桌面成90°，旋轉(zhuǎn)小鼠，使LPS溶液均勻分布于兩肺；再次給頸部消毒，縫合關(guān)閉切口，然后放回清潔實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)正常飼養(yǎng)。30 min后B組給予50 μl的IL-4(10 ng/μl)溶液氣管滴注，A、C組接受等劑量的PBS溶液氣管滴注。12 h后3組小鼠經(jīng)異氟醚誘導(dǎo)后處死收集血清和組織樣本，置于-80 ℃保存，以備后續(xù)分析。

1.2.2.1 肺組織干濕比：在預(yù)冷的 PBS 溶液中反復(fù)漂洗干凈并用吸水紙將肺組織表面的液體充分吸干，用電子天平進(jìn)行肺組織稱重，此為濕重(W)；隨后將肺組織置于烘干箱內(nèi)充分烘干，再次稱重，即為干重(D)。

1.2.2.2 蘇木精-伊紅染色及病理評(píng)分：小鼠處死后，解剖取出各組小鼠肺組織標(biāo)本，用PBS沖洗。以組織樣本醇2×1.5 h、100%酒精2×1 h、二甲苯乙醇混合液25 min、二甲苯25 min處理，隨后將樣品上蠟，用石蠟-Ⅰ和石蠟-Ⅱ包埋2 h后，將樣本切片，蘇木精-伊紅染色，按照常規(guī)方法進(jìn)行光鏡觀察，采用Smith法[4]進(jìn)行病理評(píng)分。

1.2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：取小鼠血樣1.5～2 mL，1 500 g離心15 min后，血清標(biāo)本-80 ℃保存。使用ELISA法測(cè)定TNF-α、MCP-1、IL-4、IL-10的表達(dá)水平。

1.2.2.4 外周血巨噬細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)和體外分析:從腹部動(dòng)脈采集血液樣本，血液樣本在30 min內(nèi)用1%肝素預(yù)處理抗凝，進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞分離，收集細(xì)胞，用3% BSA在PBS中封閉30 min，加入FITC-抗-F4/80抗體和PE-抗-iNOS+抗體/PE-抗-CD206抗體，避光培養(yǎng)。使用ExpressPlus程序?qū)?xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。同時(shí)，為了排除非特異性結(jié)合，使用熒光抗體將細(xì)胞與FITC同型和PE同型混合。M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記為F4/80+和iNOS+，而M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記為F4/80+和CD206+。

1.2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析:使用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)從細(xì)胞中提取總RNA，然后采用PrimeScript RT Reagent試劑盒(Takara，Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)。采用不同的試劑盒(SYBR Premix Ex Taq II，Takara，Japan)在7900HT實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中對(duì)mRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。2-ΔΔCt計(jì)算iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 外源性IL-4對(duì)MH-S細(xì)胞活力的影響：外源性IL-4作用24 h后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)活力沒有影響，見圖1(目錄后)。

2.2 外源性IL-4對(duì)LPS刺激MH-S細(xì)胞炎癥因子的影響：1.0 μg/mL的LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量明顯升高(P<0.05);給予20 ng/mL的外源性IL-4后，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平有不同程度的下降(P<0.05)，見圖2(目錄后)。

2.3 外源性IL-4對(duì)LPS刺激MH-S細(xì)胞中NF-κB p65的影響:1.0 μg/mL的LPS作用MH-S細(xì)胞24 h后，細(xì)胞NF-κB p65 蛋白表達(dá)量升高;給予不同濃度的外源性IL-4刺激后，MH-S 細(xì)胞 NF-κB p65蛋白表達(dá)量下調(diào)，見圖3(目錄后)。

2.4 外源性IL-4對(duì)LPS刺激MH-S細(xì)胞ROS水平的影響:空白對(duì)照組基本無熒光，見圖4A(目錄后)；1.0 μg/mL的LPS作用MH-S細(xì)胞24 h后，ROS表達(dá)量明顯升高,見圖4B(目錄后)。給予不同濃度的外源性IL-4刺激后，MH-S 細(xì)胞ROS表達(dá)量顯著下調(diào)，見圖4C、圖4D(目錄后)。

2.5 外源性IL-4降低肺組織損傷病理評(píng)分及W/D：造模后12 h，A組小鼠可見彌漫性肺組織病理損傷與改變，其病理評(píng)分顯著高于B組和C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組小鼠病理評(píng)分高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組小鼠W/D比值最高，反映肺組織炎性滲出與水腫嚴(yán)重；B組W/D比值顯著低于A組，但高于C組(P<0.05)，見表1。

表1 3組小鼠肺組織損傷病理評(píng)分及W/D比較

2.6 外源性IL-4調(diào)節(jié)M1/M2樣巨噬細(xì)胞表達(dá)以及炎癥因子的表達(dá)：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1和M2巨噬細(xì)胞的極化，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，LPS顯著誘導(dǎo)F4/80+CD206+M2樣巨噬細(xì)胞和F4/80+iNOS+M1樣巨噬細(xì)胞的百分比增加(P<0.05)；與A組相比，IL-4治療抑制了F4/80+iNOS+的增加，而上調(diào)了F4/80+CD206+的表達(dá)。采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的含量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)后M1表型中iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，而增加IL-4會(huì)抑制這些炎癥因子表達(dá)(P<0.05)。雖然LPS組M2表型的IL-10和TGF-β mRNA表達(dá)水平也較對(duì)照組升高(P<0.05)，隨著IL-4的加入，IL-4促進(jìn)了這些基因mRNA的表達(dá)。為闡明LPS小鼠的炎癥反應(yīng)，采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-10的相對(duì)表達(dá)，結(jié)果表明，相較于C組，A組和B組TNF-α、MCP-1、IL-10的蛋白表達(dá)水平均升高；與LPS組比較，IL-4治療后TNF-α和MCP-1水平顯著下調(diào)，IL-10水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見表2。

表2 3組小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)及炎癥因子變化

2.7 IL-4通過抑制NF-κB/p65信號(hào)通路發(fā)揮作用：為明確IL-4在膿毒癥肺損傷小鼠體內(nèi)的作用機(jī)制，采用免疫組化(IHE)和Western blot方法檢測(cè)NF-κB/p65信號(hào)通路相關(guān)基因的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。IHE檢測(cè)顯示，LPS誘導(dǎo)后p65陽性細(xì)胞百分比明顯增加，IL-4抑制LPS誘導(dǎo)后p65陽性細(xì)胞百分比增加，IL-4處理組小鼠p65細(xì)胞百分比顯著低于LPS組(P<0.05)。此外，與對(duì)照組相比，LPS小鼠p65蛋白表達(dá)上調(diào)，這也受到IL-4濃度增加的抑制;LPS對(duì)p65磷酸化的促進(jìn)作用被IL-4顯著抑制(P<0.05)，見表3。

表3 3組小鼠IL-4對(duì)NF-κB/p65信號(hào)通路作用的比較

3 討論

本研究通過建立LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺損傷體內(nèi)及體外模型，評(píng)估外源性IL-4對(duì)膿毒癥的治療作用，以期為膿毒癥提供一種新的治療方法。結(jié)果表明，外源性IL-4減少LPS誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞促炎因子 TNF-α、IL- 6、IL-1β的釋放，降低了ROS的表達(dá)及P65的蛋白表達(dá)。此外，外源性IL-4增加F4/80+CD206+M2樣巨噬細(xì)胞，抑制了F4/80+iNOS+M1樣巨噬細(xì)胞的分布，抑制膿毒癥肺損傷小鼠iNOS、TNF-α、MCP-1的表達(dá)，上調(diào)IL-10和TGF-β的表達(dá)，抑制LPS引起的p65磷酸化，從而對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肺損傷產(chǎn)生治療作用。

IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，其主要作用是促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，減少Th1細(xì)胞的形成。IL-4 是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用；在炎癥反應(yīng)中IL-4是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，同時(shí)它還能廣泛抑制其他促炎因子及炎癥介質(zhì)的表達(dá)。IL-4 能夠下調(diào)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎癥因子以及超氧化合物，還可以誘導(dǎo)IL-1受體拮抗劑基因的表達(dá)，從而間接抑制IL-1的作用[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-4還能促進(jìn)抗炎因子IL-10的分泌[7]。另外，IL-4可以通過激活JAK/STAT6信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化[8]。研究表明，IL-4能明顯抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的IL-1、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生[9]。此外，IL-4可通過抑制IKK激酶的活性，進(jìn)一步抑制 NF-κB信號(hào)通路活化，從而影響上游和下游炎癥因子水平[10]。

巨噬細(xì)胞與炎癥和宿主對(duì)各種病原體的防御密切相關(guān)。激活的巨噬細(xì)胞分為經(jīng)典激活型或M1型，交替激活型或M2型。典型的M1巨噬細(xì)胞受到“促炎”細(xì)胞因子譜的刺激，而替代的M2巨噬細(xì)胞似乎參與免疫抑制和組織修復(fù)，其促炎細(xì)胞因子分泌水平降低或?yàn)榱鉡11]。巨噬細(xì)胞的各種功能與受體相互作用的形式和細(xì)胞因子的出現(xiàn)有關(guān)，巨噬細(xì)胞極化是膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的重要過程，本研究發(fā)現(xiàn)與LPS組相比，IL-4處理抑制了F4/80+iNOS+的增加，且促進(jìn)了F4/80+CD206+的上調(diào)。IL-4可以調(diào)節(jié)M1表型和M2表型相關(guān)基因的含量，從而可誘導(dǎo)M1/M2巨噬細(xì)胞極化，減輕肺損傷和免疫缺陷。

活性氧 (ROS) 是氧化應(yīng)激的重要的組成部分，參與機(jī)體的氧化平衡。ROS的功能包括對(duì)細(xì)菌和寄生蟲的直接抗菌活性、免疫信號(hào)的氧化還原調(diào)節(jié)和炎癥小體活化的誘導(dǎo)，超過細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)能力的ROS水平會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激，過度的氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等細(xì)胞成分造成損害，并導(dǎo)致膿毒癥的加重[12]。本研究發(fā)現(xiàn)與LPS組相比，IL-4處理抑制了ROS的生成，以減輕膿毒癥相關(guān)損傷。

NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，與缺血和其他神經(jīng)炎癥性疾病后的炎癥反應(yīng)有關(guān)。NF-κB激活后上調(diào)或誘導(dǎo)的各種類型的靶基因，這些靶基因包含種類繁多的細(xì)胞因子和趨化因子，其中大部分以促炎方式起作用，它們通常導(dǎo)致NF-κB 激活，從而構(gòu)成正反饋回路[13]。Ge等人發(fā)現(xiàn)，非膿毒癥患者NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)水平較膿毒癥者低，且在膿毒癥患者靜脈血中IL-6、IL-18和TNF-α的表達(dá)水平與NF-κB百分比呈正相關(guān)性[14]。p65(RelA)是NF-κB家族的成員之一，它以同源或異源二聚體結(jié)合抑制κB(IκB)家族蛋白的形式分布于未受刺激的細(xì)胞中。有研究表明，通過抑制典型的NF-κB通路，可以阻止促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性受p65在多個(gè)絲氨酸殘基的磷酸化控制[15]。本研究結(jié)果顯示，LPS引起的p65磷酸化被外源性IL-4抑制，提示外源性IL-4可以抑制NF-κB/p65信號(hào)通路的激活，但外源性IL-4與其他信號(hào)通路的相關(guān)性還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，采用LPS建立膿毒癥肺損傷細(xì)胞及小鼠模型，結(jié)果顯示外源性IL-4能夠抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)、減少ROS生成、降低肺組織病理評(píng)分和W/D值，對(duì)改善肺損傷有積極作用。此外，外源性IL-4可促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，并抑制NF-κB/p65信號(hào)通路激活。