金麗娟,范海濤,馬曉燕,陳 淼,張愛蕓

肝癌是世界上最常見的癌癥之一，全球因肝癌死亡的人數(shù)已超過80萬。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，在未來10年內(nèi)預(yù)計(jì)將有100多萬患者將死于肝癌[1]。肝癌的危險(xiǎn)因素包括乙型或丙型肝炎、肝硬化、酗酒、環(huán)境因素以及酒精性脂肪肝、糖尿病和肥胖等代謝性疾病，還包括吸煙以及遺傳因素[2]。雖然外科手術(shù)切除和肝移植等治療方法的進(jìn)步顯著提高了肝癌患者的預(yù)期壽命，然而這些治療手段主要適合肝癌晚期患者[3]。此外，經(jīng)動(dòng)脈化栓塞治療(TACE)已經(jīng)成為重要的肝癌姑息治療方法，然而根據(jù)目前的臨床證據(jù)，TACE對(duì)具有某些特定遺傳特征的肝癌患者并沒有明顯的療效[4]。因此，有必要深入探討肝癌的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)。本研究擬通過數(shù)據(jù)庫分析以及體外研究初步探討SERPINE1在肝癌細(xì)胞增殖中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料:2019年6月基于GEPIA數(shù)據(jù)庫資料，分析SERPINE1在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。篩選條件：①Expression DIY；②Gene：SERPINE1；③|Log2FC|Cutoff：1；④p-value Cutoff：0.05；⑤Datasets Selection：LIHC；⑥Log Scale：Yes；⑦M(jìn)atched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑: Trizol RNA提取試劑、miScript Ⅱ RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；SYBR Mastermix購自北京天根生化科技有限公司；SERPINE1過表達(dá)載體以及Real-time PCR檢測引物委托上海吉馬有限公司合成；Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；CCK-8檢測試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):人肝癌細(xì)胞系Huh-7、HB611、SMMC-7721以及HepG2細(xì)胞均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。HCCLM3細(xì)胞購自中喬新舟(上海)有限公司。各細(xì)胞系復(fù)蘇后加入含有10%胎牛血清以及1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞長至鋪滿培養(yǎng)瓶時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.3 熒光定量 PCR:采用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，將其稀釋成50 μg/mL，使用特異性反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Green qPCR Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)。檢測溶解曲線，分析各樣本Ct值，分別以GAPDH或者U6為內(nèi)參，2-(△△Ct)法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中所用引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:待細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照1.5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度將其接種于6孔板中，采用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將空載體Vector或者SERPINE1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后用Real-time PCR檢測SERPINE1的表達(dá)驗(yàn)證過表達(dá)效率。

1.2.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖:將各組細(xì)胞按照2×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)0 、24、48、72 h和96 h后，各孔加入100 μl的混合培養(yǎng)液，其中含有90 μl的DMEM完全培養(yǎng)液以及10 μl的CCK-8試劑培養(yǎng)細(xì)胞3 h，于標(biāo)儀上測定各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度值。

1.2.6 雙熒光素酶活性檢測:采用SERPINE1的野生型載體(SERPINE1-wt)或者其突變型載體(SERPINE1-mut)，分別和NC mimic或者miR-660 mimic共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞檢測SERPINE1與miR-660的結(jié)合情況，轉(zhuǎn)染48 h后采用素酶活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，2組間比較采用t檢驗(yàn)、ANOVA檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SERPINE1在肝癌組織中的表達(dá):利用GEPIA網(wǎng)站分析來自TCGA和GTEx項(xiàng)目的369例肝癌樣本以及160例癌旁組織中SERPINE1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在肝癌組織中SERPINE1的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1(封二)。

2.2 SERPINE1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá):熒光定量PCR檢測了5株肝癌細(xì)胞中SERPINE1的表達(dá)，結(jié)果顯示SERPINE1的mRNA在肝癌細(xì)胞Huh-7、HCCLM3、HB611、SMMC-7721以及HepG2中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、3.36±0.25、1.58±0.09、0.25±0.08、0.86±0.21，因此選擇SERPINE1表達(dá)最低的SMMC-7721和表達(dá)最高的HCCLM3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。在SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SERPINE1過表達(dá)載體，48 h后采用熒光定量PCR檢測SERPINE1的表達(dá)，結(jié)果顯示，SERPINE1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中SERPINE1的表達(dá)顯著高于空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(6.01±0.72與1.21±0.32)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在HCCLM3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SERPINE1干擾片段，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，3個(gè)SERPINE1 siRNA片段轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中SERPINE1的表達(dá)水平均顯著降低(0.89±0.06與0.31±0.05、0.63±0.03、0.55±0.05)。其中，SERPINE1 siRNA1的干擾效果最好(P<0.05)，因此，選擇SERPINE1 siRNA1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 SERPINE1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響:分別于轉(zhuǎn)染SERPINE1過表達(dá)載體或者干擾片段后的不同時(shí)間點(diǎn)采用CCK-8檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染SERPINE1過表達(dá)載體后細(xì)胞增殖水平降低,見表2；轉(zhuǎn)染SERPINE1干擾片段之后細(xì)胞的增殖水平升高,見表3。結(jié)果提示SERPINE1能夠負(fù)向調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖。

表2 過表達(dá)SERPINE1對(duì)細(xì)胞增殖的影響

表3 下調(diào)SERPINE1對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.4 miR-660對(duì)SERPINE1的調(diào)控作用:預(yù)測顯示SERPINE1上存在有miR-660的結(jié)合位點(diǎn)(圖2，封二)，因此采用雙熒光素酶檢測了二者的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，野生型SERPINE1載體與miR-660 mimic共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中雙熒光素酶的活性顯著低于其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2(封二)。此外，在HCCLM3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-660 mimic，48 h后檢測SERPINE1的表達(dá)，結(jié)果顯示與NC mimic轉(zhuǎn)染組相比，miR-660 mimic轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中SERPINE1水平顯著降低(0.95±0.09與0.57±0.05，P<0.05)，提示SERPINE1受到miR-660的靶向調(diào)控。

2.5 SERPINE1介導(dǎo)了miR-660對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的調(diào)控:在HCCLM3細(xì)胞中分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-660或者共轉(zhuǎn)染miR-660和SERPINE1，轉(zhuǎn)染48 h后CCK-8檢測各組細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比NC mimic組的增殖能力沒有顯著變化(0.584±0.052與0.623±0.074，P>0.05)；與NC mimic轉(zhuǎn)染組相比，miR-660 mimic顯著促進(jìn)了細(xì)胞的增殖(0.623±0.074與1.342±0.141，P<0.05)；與miR-660 mimic組相比，miR-660-mimic+Vector組無顯著變化(1.342±0.141與1.285±0.082，P>0.05)；與miR-660-mimic+Vector組相比，miR-660-mimic+SERPINE1細(xì)胞的增殖能力顯著降低(1.285±0.082與0.833±0.136，P<0.05)。

3 討論

SERPINE1是一種纖維蛋白溶解抑制劑，已有多項(xiàng)研究證明其在癌癥中的異常表達(dá)，如SERPINE1在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)，并與腫瘤的遷移和侵襲有關(guān)[5]。此外，有報(bào)道SERPINE1與黑色素瘤[6]、食管癌[7]和膀胱癌[8]的進(jìn)展有關(guān)，然而其在肝癌中的作用還未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，SERPINE1在肝癌組織中顯著降低，并且高表達(dá)SERPINE1能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，下調(diào)SERPINE1可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，因此，推測SERPINE1能在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤的作用，上調(diào)SERPINE1有望成為治療肝癌的新方法。

miR-660-5p也被簡稱為miR-660，目前被證明為一個(gè)促腫瘤的miRNA，抑制miR-660的表達(dá)能夠抑制乳腺癌的增殖及轉(zhuǎn)移[9]。轉(zhuǎn)染了miR-660 inhibitor的腎癌細(xì)胞增殖能力顯著降低，則細(xì)胞的凋亡率顯著升高[10]。前期研究結(jié)果顯示，lncRNA ASMTL-AS1可以通過吸附miR-660調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖[11]，然而miR-660通過何種機(jī)制影響肝癌細(xì)胞增殖仍未十分明確。miRNA是一類長度在20～25個(gè)堿基的內(nèi)源性非編碼RNA，miRNA能夠結(jié)合于互補(bǔ)mRNA的3′非翻譯區(qū)，誘導(dǎo)靶mRNA的降解或者抑制其翻譯。本研究結(jié)果證明miR-660能夠靶向調(diào)控SERPINE1，上調(diào)miR-660能夠顯著抑制SERPINE1的表達(dá)。因此，我們推測miR-660通過調(diào)控SERPINE1影響了肝癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究結(jié)果表明SERPINE1能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并且將SERPINE1作為miR-660的靶基因，能夠介導(dǎo)miR-660對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的調(diào)控，上調(diào)SERPINE1有望成為抗肝癌的潛在的治療手段。