馬玉剛，楊曉明 ，楊福順，陳夢(mèng)飛，呂 剛

膿毒癥(Sepsis)是由各種感染因素造成的機(jī)體反應(yīng)不平衡，常累積多個(gè)臟器[1]，其中最重要的環(huán)節(jié)是炎癥失調(diào)，這發(fā)生在膿毒癥病程的從頭到尾，造成這種現(xiàn)象的致病物質(zhì)包含細(xì)菌、真菌、寄生蟲、病毒等生物體。盡管膿毒癥的治療方法取得了重大進(jìn)展，但它仍然是威脅全世界人民生命健康安全的關(guān)鍵因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2017年的膿毒癥病例約為4 890萬人，其中大概有100萬最終為死亡[2]。由于膿毒癥的表現(xiàn)形式多樣，臨床醫(yī)生在膿毒癥患者的診斷、治療和管理方面繼續(xù)面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種含膜小泡樣物質(zhì)，能夠于各種各樣細(xì)胞間定向運(yùn)輸物質(zhì)，對(duì)于細(xì)胞彼此間的聯(lián)系及轉(zhuǎn)運(yùn)遞質(zhì)發(fā)揮著不可或缺的作用。越來越多關(guān)于EVs的研究為膿毒癥的診治提供了思路，現(xiàn)就EVs在膿毒癥中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 概述

EVs是囊括細(xì)胞中釋放的各種有膜亞型的統(tǒng)稱，主要包含外泌體、微囊泡和凋亡小體，能夠攜帶各種核酸、脂質(zhì)、胞漿蛋白、受體和其他小信號(hào)分子[3]。在細(xì)胞外環(huán)境中對(duì)EVs的首次觀察可以追溯到1940年后期，當(dāng)時(shí)學(xué)者CHARGAFF和WEST觀察到EVs作為血小板促凝衍生顆粒存在于正常血漿中[4]。此后，EVs已能夠在大多數(shù)細(xì)胞和生物體液中分離開來。在過去的十年中，EVs因可以運(yùn)載生物大分子，并造成受體與親代細(xì)胞的性能改變，被看作不同細(xì)胞間傳遞信息的有效載體。最近的證據(jù)表明它們?cè)诨炯?xì)胞功能中起著關(guān)鍵作用，如免疫防御、遺傳和表觀遺傳信息共享等。EVs可以呈現(xiàn)不同的受體、分子，通過與細(xì)胞膜的融合或胞吞功能把信號(hào)分子傳遞給另外的細(xì)胞以表達(dá)作用。

2 EVs在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的作用

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞EVs參與膿毒癥炎癥反應(yīng):內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)是血管內(nèi)的免疫細(xì)胞，能夠在細(xì)菌感染后的全身反應(yīng)中限制其傳播。內(nèi)皮細(xì)胞與無數(shù)炎癥介質(zhì)以及先天免疫和凝血系統(tǒng)的元素處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以協(xié)調(diào)膿毒癥中的宿主反應(yīng)。內(nèi)皮表面的屏障功能在感染性休克中幾乎均勻受損，這很可能導(dǎo)致不良后果。研究表明，外泌體可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。外源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)可以減少血管滲漏、改善器官功能并提高膿毒癥患者存活率。ZHOU Y[5]等假設(shè)EPC通過外泌體介導(dǎo)的microRNA(miRNA)轉(zhuǎn)移來保護(hù)微血管系統(tǒng)，并通過研究證明，EPC外泌體治療減輕了肝腎功能損害，降低了細(xì)胞因子和趨化因子，顯著改善了膿毒癥小鼠的存活率。

2.2 巨噬細(xì)胞EVs啟動(dòng)膿毒癥炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng):巨噬細(xì)胞分為傳統(tǒng)激活(M1)和交替激活(M2)兩種，它們分別表現(xiàn)出促炎和抗炎表型，這兩種亞型之間的平衡在調(diào)節(jié)組織炎癥、損傷和修復(fù)過程。最近的研究表明，組織細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過釋放小的EVs相互作用，在這些過程中受壓組織細(xì)胞釋放的EVs可以促進(jìn)相鄰巨噬細(xì)胞的活化和極化，進(jìn)而釋放EVs和促進(jìn)細(xì)胞應(yīng)激的因子和組織炎癥和損傷[6]。膿毒癥期間會(huì)出現(xiàn)具有明顯免疫抑制的抗炎表型，在此期間中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞限制其Toll樣受體4對(duì)細(xì)菌脂多糖(LPS)的反應(yīng)。之前報(bào)道顯示，在這種LPS耐受狀態(tài)下，不同的信號(hào)通路抑制不同的促炎細(xì)胞因子如TNFα和IL-6的轉(zhuǎn)錄和翻譯[7]。鄭伯俊等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激下巨噬細(xì)胞釋放的EVs能夠造成小鼠急性肺損傷。DING L等[9]研究證明，巨噬細(xì)胞衍生的EVs(Mac-EVs)不僅能抑制炎癥性單核細(xì)胞的動(dòng)員，而且可以緩解隨之而來的細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而緩解小鼠的膿毒癥癥狀。

2.3 其他來源EVs通過復(fù)雜機(jī)制參與膿毒癥炎癥反應(yīng):在膿毒癥中，血小板低于50×109/L往往表明情況危急，作為凝血反應(yīng)和免疫系統(tǒng)的匯聚點(diǎn)，血小板被看作是膿毒癥治療的切入點(diǎn)。血清外泌體產(chǎn)生的miR-155分別通過作用于SHIP1和SOCS1增加巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)和炎性反應(yīng)。研究表明，分泌到外周血中的循環(huán)外泌體釋放的miR-155是造成膿毒癥肺損傷的重要物質(zhì)。免疫細(xì)胞衍生的EVs會(huì)導(dǎo)致循環(huán)單核細(xì)胞功能受損，并有助于膿毒癥的發(fā)展和持續(xù)存在。高水平的單核細(xì)胞EVs與死亡率相關(guān)，有助于對(duì)病情較重的患者進(jìn)行早期分級(jí)。腸上皮細(xì)胞(IEC)衍生的腔內(nèi)EVs攜帶減輕促炎反應(yīng)的miRNA，在膿毒癥期間釋放的IECEVs將調(diào)節(jié)性miRNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，可能有助于改善腸道炎癥[10]。

3 EVs在膿毒癥疾病評(píng)估中的作用

實(shí)驗(yàn)顯示，膿毒癥休克患者釋放的EVs濃度明顯增加，在白細(xì)胞來源的EVs中，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的EVs數(shù)量最高。這些發(fā)現(xiàn)提高了采用EVs計(jì)數(shù)作為膿毒癥休克識(shí)別工具的可能性。研究表明，EPC衍生的EV通過巨噬細(xì)胞M2極化傳輸TUG1以減輕膿毒癥，該研究還強(qiáng)調(diào)了miR-9-5p介導(dǎo)的 SIRT1 能夠抑制相關(guān)的促炎機(jī)制，這些結(jié)果有助于更全面地了解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制[11]。內(nèi)皮細(xì)胞外泌體含有HSPA12B，可以被巨噬細(xì)胞攝取。有趣的是，在LPS刺激的巨噬細(xì)胞中，內(nèi)皮細(xì)胞外泌體HSPA12B明顯增加IL-10水平，并減少TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。研究表明，內(nèi)皮外泌體HSPA12B下調(diào)了LPS刺激的巨噬細(xì)胞中NF-κB的激活和核轉(zhuǎn)位。這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮細(xì)胞HSPA12B在膿毒癥期間通過外泌體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞促炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮了新的作用，膿毒癥誘發(fā)的心肌病和死亡率與內(nèi)皮細(xì)胞HSPA12B的缺乏有關(guān)[12]。在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷中，EPC衍生的EVs對(duì)攜帶miR-93-5p的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用通過調(diào)節(jié)KDM6BH/3K27me3/TNF-α軸介導(dǎo)，其中的miR-375-3p可激活BRD4介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路改善膿毒癥大鼠心肌損傷，為膿毒癥心肌損傷提供治療靶點(diǎn)[12]。MIN GAO等[13]關(guān)于膿毒癥期間外泌體miRNAs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞影響的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)大鼠進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)后，miR-1-3p的增加和應(yīng)力相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白1(SERP1)的減少在大鼠體內(nèi)和體外都有表達(dá)。SERP1是miR-1-3p的一個(gè)直接靶基因，上調(diào)的miR-1-3p通過靶向SERP1抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨架收縮，增加單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性和膜損傷，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減弱血管屏障保護(hù)作用，參與急性肺損傷的發(fā)生。骨間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)衍生的細(xì)胞外囊泡已被證明可以轉(zhuǎn)移微小分子(蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA 和脂質(zhì))以緩解膿毒癥。有研究表明，源自BMSCs-EVs的MiR-17調(diào)節(jié)BRD4介導(dǎo)的EZH2/TRAIL軸，從根本上抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥[14]。YAO M等在白細(xì)胞介素1β(IL-1β)預(yù)處理的小鼠MSCs(βMSCs)中分離出外泌體，并將它們注射到CLP膿毒癥模型中，證明了βMSCs衍生的外泌體抑制了miR-21的靶基因PDCD4對(duì)巨噬細(xì)胞極化和敗血癥的影響。外泌體miR-21 成為 IL-1β 預(yù)處理誘導(dǎo)的 MSCs 免疫調(diào)節(jié)特性的關(guān)鍵介質(zhì)，該研究為 MSCs 在膿毒癥中的治療應(yīng)用提供了新的基礎(chǔ)[15]。

4 EVs在膿毒癥治療中的作用

膿毒癥可誘發(fā)心肌功能障礙，而EPCs衍生的EVs可減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)說明EPCs-EVs中的miR-375-3p可激活BRD4介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路改善膿毒癥大鼠心肌損傷，為膿毒癥心肌損傷提供治療靶點(diǎn)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，EPCs-EVs過表達(dá)miR-125b-5p，通過抑制TOP2A來保護(hù)膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷，這可能有助于急性肺損傷的治療策略[16]。最近的證據(jù)證明，糖酵解在通過代謝重編程調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化中起重要作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可通過分泌外泌體減輕膿毒癥引起的肺損傷，并具有有效的免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制特性。BMSCs-EVs通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)下調(diào)了幾種糖酵解必需蛋白的表達(dá)，建立了 LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)模型后，研究人員發(fā)現(xiàn)BMSCs衍生的外泌體改善了LPS誘導(dǎo)的炎癥和肺病理損傷。同時(shí)，氣管內(nèi)遞送BMSCs衍生的外泌體可有效下調(diào) LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織糖酵解[17]。硫醇特異性過氧化物酶(Peroxiredoxin-4，Prdx4)通過干擾Caspase-1活性直接調(diào)節(jié)IL-1β的產(chǎn)生，Prdx4確定為炎癥小體活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并為通過巨噬細(xì)胞衍生的EVs對(duì)炎癥小體的遠(yuǎn)程細(xì)胞間通訊功能提供新的見解[18]。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)已被證明可以減輕ARDS和膿毒癥造成的器官損害；研究發(fā)現(xiàn)脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)增加的Akt磷酸化主要由外泌體在組蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和肺損傷中介導(dǎo)。此外，來自組蛋白暴露的ADSC在外泌體中miR-126 的表達(dá)增加。值得注意的是，抑制 ADSCs中的miR-126未能增加暴露于組蛋白的HUVECs中的Akt 磷酸化，這說明ADSCs衍生的外泌體可能通過激活PI3K/Akt通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[19]，證明了ADSCs 外泌體通過調(diào)節(jié) Nrf2/HO-1 的表達(dá)來減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥并在膿毒癥中發(fā)揮保護(hù)作用。ADSCs 外泌體增強(qiáng) Nrf2 的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，同時(shí)下調(diào)其介質(zhì) Keap1。在體內(nèi)膿毒癥模型中，靜脈注射 ADSCs 外泌體可緩解炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴和器官損傷，同時(shí)促進(jìn) HO-1的表達(dá)[20]。

EVs在膿毒癥中的應(yīng)用具有廣泛的臨床前景，許多研究都說明了EVs可能在膿毒癥中發(fā)揮著重要作用，然而，EVs在膿毒癥診治的實(shí)際應(yīng)用中還面臨很多困難。不同來源的EVs作用機(jī)制大有不同，并且EVs的分離、提取過程尚未規(guī)范化，在處理方面仍需要建立標(biāo)準(zhǔn)化流程。同樣，我們了解到是大部分關(guān)于EVs的實(shí)驗(yàn)均以動(dòng)物模型或是在生物體外為基礎(chǔ)，并未在人體上應(yīng)用，未來還須進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以便于更好地觀察EVs的臨床療效，從生物標(biāo)志物到膿毒癥的臨床治療，EVs需要更多、更完善的研究進(jìn)行評(píng)估。