梁 爽,周 波,馬小麗,

肝纖維化是由多種慢性致病因素所致的進(jìn)行性、彌漫性肝臟病變，發(fā)生的中心環(huán)節(jié)主要是肝星形細(xì)胞(HSC)的激活，HSC的激活可導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生,EMT是可逆的，可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)通路來(lái)干預(yù)EMT的過(guò)程。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)可介導(dǎo)HSC和成纖維細(xì)胞的活化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積；ECM沉積的來(lái)源也包括發(fā)生EMT的肝細(xì)胞與膽管細(xì)胞,抑制TGF-β1信號(hào)通路能有效阻止HSC的活化[1]。臨床證實(shí)養(yǎng)營(yíng)活血湯治療肝纖維化臨床有效率為92.5%[2],可降低大鼠血清TNF-α和IFN-γ含量，抑制NF-kB mRNA的表達(dá)，降低肝纖維化大鼠血清TGF-β1濃度及肝組織α-SMA的表達(dá)，直接或間接抑制了HSC的活化而改善肝組織的纖維化程度[3-5]。本研究探討?zhàn)B營(yíng)活血湯抗肝纖維化的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體重180～220 g。大鼠均使用消毒籠具分籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)大鼠合成飼料，飲用自來(lái)水，環(huán)境溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.2 藥物及試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物：養(yǎng)營(yíng)活血湯由當(dāng)歸、川芎、熟地、白芍、黨參、丹參、陳皮、茯苓、鱉甲、柴胡、炙甘草、大棗12味藥物組成，所需中藥均購(gòu)自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院銀川醫(yī)院。用冷水浸泡中藥40 min后，進(jìn)行煎煮、過(guò)濾、濃縮，制成水煎劑，滅菌分裝，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。養(yǎng)營(yíng)活血湯按高劑量4.734 g/mL，每日2 mL/200 g 劑量灌胃1次，持續(xù)灌胃8周。鱉甲煎丸，杭州胡慶余堂有限公司生產(chǎn)，批號(hào):180810;每日以540 mg/kg體重灌胃，持續(xù)灌胃8周;秋水仙堿粉，購(gòu)于上海展云化工有限公司，用前用蒸餾水配制成懸濁液,每日以0.2 mg/kg體重灌胃，持續(xù)灌胃8周。

1.2.2 主要試劑：RIPA裂解液、DEPC水購(gòu)置于北京索萊寶科技有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于中杉金橋公司，PVDF膜購(gòu)于Millipore公司，X射線膠片購(gòu)于Carestream公司。一抗：Vimentin、TGF-β1、α-SMA(均來(lái)自BIOSS兔多抗);氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇均購(gòu)置于天津市永大化學(xué)試劑有限公司;HiFiScriptT 快速去除基因組cDNA第一條鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture 熒光定量試劑盒為康為試劑。

1.2.3 主要儀器設(shè)備： 稱量天平(Sartorius公司)，低溫高速離心機(jī)，蛋白濃度定量?jī)x，移液器，離心機(jī)，生物分光光度(Eppendorf公司)，超低溫冰箱(SANYO公司)，超純水儀(北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司)，電泳儀(北京六一公司)，半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(ATTO公司)，轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)，分析儀器(Tanon 公司)，旋振蕩儀(QL-902海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)，熒光定量PCR儀(Biosystems)。

1.3 方法

1.3.1 建立肝纖維化大鼠模型及分組給藥：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、養(yǎng)營(yíng)活血湯治療組、秋水仙堿治療組、鱉甲煎丸治療組共5組，每組12只。除空白對(duì)照組外，其余4組均按經(jīng)典的四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型造模方式，并輔以高脂肪、低蛋白飲食及乙醇飲料配合作為飲食控制條件，皮下給予 40% CCl4與石蠟油混合液注射，首劑注射量依照5 mL/kg體重標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，之后依照3 mL/kg體重計(jì)算，每4 d 注射1次；同時(shí)在注射CCl42 d后腹腔予豬血清注射，首次2 mL/kg，之后1 mL/kg，每4 d注射1次，造模6周。為排除晝夜節(jié)律的影響，每天定時(shí)給藥，各組均持續(xù)給藥6周。

1.3.2 肝組織樣本采樣：處死大鼠后摘取肝臟，取大鼠相同部位肝葉，制備肝組織樣本。

1.3.3 蛋白指標(biāo)檢測(cè)：Western blot法檢測(cè)肝組織樣本。液氮下研磨，加入RIPA裂解液，4 ℃冰箱過(guò)夜，離心后取上清液，經(jīng)測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行對(duì)比后調(diào)成一個(gè)最終濃度，經(jīng)煮沸、變性、上樣、跑膠、轉(zhuǎn)膜等步驟，洗膜后在4℃條件下分別放在 TGF-β1(1∶1 000配置)、Vimentin(1∶1 000配置)、α-SMA(1∶3 000配置)抗體配置液中(需過(guò)1夜)，洗膜后進(jìn)行二抗工作液反應(yīng)，根據(jù)條帶的亮度適當(dāng)選擇曝光時(shí)間并條帶掃描分析結(jié)果。所測(cè)目的蛋白TGF-β1、Vimentin、α-SMA表達(dá)水平以灰度比(目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值)表示。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR檢測(cè))：內(nèi)參基因擴(kuò)增用的引物表見(jiàn)表1。檢測(cè)樣本中目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，采用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析，擴(kuò)增后進(jìn)行溶解曲線分析。依據(jù)公式計(jì)算得到TGF-β1、Vimentin、α-SMA mRNA的相對(duì)含量,見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)目的基因引物

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織中TGF-β1、Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá):養(yǎng)營(yíng)活血湯組與其他組大鼠肝組織中TGF-β1、Vimentin、α-SMA 蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，養(yǎng)營(yíng)活血湯組與秋水仙堿組TGF-β1、Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；養(yǎng)營(yíng)活血湯組與模型對(duì)照組、鱉甲煎丸組α-SMA蛋白量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2與圖1(目錄后)。

表2 各組大鼠血清TGF-β1、Vimentin、α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠肝組織TGF-β1、Vimentin、α-SMAmRNA的相對(duì)表達(dá)量：養(yǎng)營(yíng)活血湯組與其他各組大鼠肝組織中TGF-β1、Vimentin、α-SMA mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肝組織中TGF-β1、Vimentin、α-SMAmRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

抑制TGF-β1信號(hào)通路能有效阻止HSC的活化[1],TGF-β1信號(hào)通路可分為T(mén)GF-β1/SMAD信號(hào)通路和非經(jīng)典的SMAD信號(hào)通路。TGF-β1/SMAD信號(hào)通路TGF-β1雙聚體先與type Ⅱ型受體連系，type Ⅱ型受體招募并磷酸化type I型受體，磷酸化后的type I型受體吸引并磷酸化regulated SMAD卵白(R-SMAD)，這些卵白再與common SMAD(coSMAD)連系。R-SMAD與coSMAD形成異元二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核后作為多種ECM基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，參與目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控[6]。非經(jīng)典的SMAD信號(hào)通路是非SMAD信號(hào)分子通過(guò)磷酸化受體激活的SMADs連接區(qū)進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo),包括MAPK、PI3K/ART、NF-kB信號(hào)通路，其中MAPK信號(hào)通路是研究最多的交叉通路[7],均參與EMT的過(guò)程。研究表明EMT參與肝纖維化過(guò)程并發(fā)揮重要作用，TGF-β1信號(hào)通路的激活，可激活Vimentin、α-SMA產(chǎn)生。Vimentin作為EMT間質(zhì)表型蛋白表達(dá)上調(diào)，從而產(chǎn)生ECM沉積，促進(jìn)肝纖維化的產(chǎn)生[8]。TGF-β1因子釋放增多，活化 HSC，刺激成纖維樣細(xì)胞的增殖，加強(qiáng)α-SMA的表達(dá)[9]。α-SMA是HSC活化的標(biāo)志，HSC活化產(chǎn)生的TGF-β1是最重要的致纖維化因子[7]。

養(yǎng)營(yíng)活血湯是由周波教授運(yùn)用溫病學(xué)理論，以營(yíng)陰虧虛、血液瘀滯為基本病機(jī)，根據(jù)多年治療肝纖維化的臨床經(jīng)驗(yàn)，制定出的中藥組方，藥物組成有當(dāng)歸、川芎、熟地、白芍、黨參、丹參、陳皮、茯苓、鱉甲、柴胡、炙甘草、大棗共12味中藥組成，本方具有益氣養(yǎng)營(yíng)、補(bǔ)血活血的作用。前期課題組經(jīng)臨床已經(jīng)證實(shí)養(yǎng)營(yíng)活血湯治療肝纖維化臨床有效率為92.5%[2]。研究表明養(yǎng)營(yíng)活血湯可降低大鼠血清TNF-α和IFN-γ含量，可明顯抑制NF-kB mRNA的表達(dá)，降低肝纖維化大鼠血清TGF-β1濃度及肝組織α-SMA的表達(dá)，直接或間接抑制了HSC的活化而改善肝組織的纖維化程度[3-5]。養(yǎng)營(yíng)活血湯高劑量組可改善纖維組織增生[10]。秋水仙堿通過(guò)對(duì)TGF-β1的抑制，以達(dá)到抗纖維化的作用;鱉甲煎丸是臨床治療肝纖維化的推薦用藥[11]。我們基于TGF-β信號(hào)通路，通過(guò)肝纖維化通路上相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，進(jìn)一步研究養(yǎng)營(yíng)活血湯對(duì)TGF-β1、Vimentin、α-SMA的影響，探討?zhàn)B營(yíng)活血湯抗肝纖維化的作用機(jī)制。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是目前公認(rèn)的纖維化疾病發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子[12]，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積促進(jìn)劑，它可以對(duì)HSC進(jìn)行活化，能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞遷移，發(fā)生EMT，從而激活成纖細(xì)胞向肌成纖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在肝纖維化形成過(guò)程中，TGF-β信號(hào)通路可調(diào)控EMT的過(guò)程，是EMT中最主要的正向調(diào)控機(jī)制之一[13]，抑制EMT可抑制纖維化的轉(zhuǎn)化。α-SMA是活化的成纖維細(xì)胞的標(biāo)志，參與合成Ⅰ型膠原、Ⅲ 型膠原、纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生，是評(píng)判肝纖維化活動(dòng)性的標(biāo)志物[14]。Vimentin是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志物，在EMT過(guò)程中Vimentin、α-SMA皆可升高。

肝纖維化的形成原因較多，病機(jī)復(fù)雜，治療手段多樣，是本虛標(biāo)實(shí)之證。本虛主要以營(yíng)陰虧虛為重要的因素，標(biāo)實(shí)以血液瘀滯為關(guān)鍵，治療則以扶正祛邪為基本原則，即補(bǔ)益營(yíng)陰、活血化瘀是重要的治療方法。養(yǎng)營(yíng)活血湯是基于“肝藏血”和“肝體陰用陽(yáng)”的理論，認(rèn)為肝纖維化的基本病機(jī)為營(yíng)虛血瘀，課題組在四物湯基礎(chǔ)上演化而成，全方具有養(yǎng)營(yíng)(養(yǎng)血)活血行氣之功效。TGF-β信號(hào)通路和EMT在肝纖維化中是非常重要的，肝纖維化可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。對(duì)于肝纖維化的西醫(yī)治療還沒(méi)有特定的藥物，中藥復(fù)方靶向調(diào)控肝纖維化是目前的治療熱點(diǎn)。

通過(guò)觀察該動(dòng)物模型對(duì)照組TGF-β、Vimentin、α-SMAmRNA和蛋白水平明顯上升，TGF-β信號(hào)通路和EMT同時(shí)產(chǎn)生，表明養(yǎng)營(yíng)活血湯可降低TGF-β、Vimentin、α-SMA的mRNA的含量，降低TGF-β、Vimentin、α-SMA蛋白的表達(dá)水平從而起到抗肝纖維化的作用。故證明養(yǎng)營(yíng)活血湯可能通過(guò)TGF-β信號(hào)通路和EMT靶點(diǎn)來(lái)治療肝纖維化，TGF-β信號(hào)通路可調(diào)控EMT的過(guò)程，通過(guò)抑制EMT的過(guò)程，從而抗肝纖維化，肯定了肝纖維化營(yíng)虛血瘀的病機(jī)內(nèi)涵，豐富了肝纖維化的理論病機(jī)內(nèi)涵，成為肝纖維化治療理念的突破口。EMT對(duì)肝癌發(fā)生具有重要意義，也為治療肝纖維化-肝硬化-肝癌提供了思路。