孫 雷，王亦琳，葉 妮，尹 暉，張 驪，黃耀凌，王鶴佳

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

作為歐洲農(nóng)業(yè)食物鏈治理的關(guān)鍵要素，歐盟官方控制規(guī)則被全世界公認(rèn)為最佳實(shí)踐的典范。歐盟法規(guī)2002/657/EC[1]對(duì)藥物殘留分析方法的實(shí)施以及對(duì)活體動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品中藥物殘留分析結(jié)果的解釋提出了要求，98/179/EC[2]規(guī)定了監(jiān)測(cè)活體動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品中藥物殘留的官方采樣詳細(xì)規(guī)則。這兩項(xiàng)決議都是在被廢除的理事會(huì)指令96/23/EC[3]的基礎(chǔ)上通過(guò)的，而且2002/657/EC不適用于在其他歐盟立法中制定了更具體規(guī)則的物質(zhì)：食品中真菌毒素[4]、食品中二噁英和二噁英樣多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls，PCB)[5]以及食品中鉛、鎘、汞和苯并(a)芘[6]。鑒于新的科學(xué)發(fā)展以及法規(guī)的確定性和完整性，法規(guī)2002/657/EC和98/179/EC應(yīng)廢除，并被新的法規(guī)取代。2021年3月22日，歐盟官方公報(bào)發(fā)布了歐盟委員會(huì)執(zhí)行條例(EU)2021/808《食品動(dòng)物用藥理活性物質(zhì)殘留分析方法的性能、結(jié)果解釋和采樣方法》，該條例替代2002/657/EC和98/179/EC，自歐盟官方公報(bào)發(fā)布后第20日即從2021年5月21日起生效。該法規(guī)的發(fā)布實(shí)施，對(duì)我國(guó)從事動(dòng)物性食品等產(chǎn)品中藥物殘留分析有很強(qiáng)的借鑒意義。

1 主要內(nèi)容

(EU)2021/808包含正文及兩個(gè)附件，正文主要包括8個(gè)方面的內(nèi)容：主題和范圍、術(shù)語(yǔ)定義、分析方法的要求、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)定、結(jié)果解釋、采樣要求、廢除法規(guī)和過(guò)渡措施、生效等。附件1列出了常用分析方法的性能標(biāo)準(zhǔn)和要求；附件2規(guī)定了動(dòng)物性食品的官方采樣程序和處理方法。

主題和范圍中規(guī)定該條例適用于活體食品動(dòng)物、動(dòng)物身體部位和體液、排泄物、組織、動(dòng)物源產(chǎn)品、動(dòng)物副產(chǎn)品、飼料和飲水中藥理活性物質(zhì)殘留的采樣、實(shí)驗(yàn)室分析方法以及分析結(jié)果的解釋。

術(shù)語(yǔ)定義中重點(diǎn)規(guī)定了49個(gè)術(shù)語(yǔ)定義：絕對(duì)回收率、準(zhǔn)確度[7]、棄真誤差(α誤差)、被分析物、批準(zhǔn)用物質(zhì)[8]、去偽誤差(β誤差)、偏差、校正標(biāo)準(zhǔn)、有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(certified reference material，CRM)[9]、共色譜法(co-chromatography)、協(xié)作研究、確證方法、包含因子(k)、確證時(shí)的判斷限(CCα)、篩查時(shí)的檢測(cè)能力(CCβ)、添加樣品、實(shí)驗(yàn)室間研究、內(nèi)標(biāo)(internal standard，IS)、關(guān)注濃度水平、最低校準(zhǔn)濃度(lowest calibrated level，LCL)、基質(zhì)、基質(zhì)效應(yīng)、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液、基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液、被測(cè)變量、測(cè)量不確定度、性能標(biāo)準(zhǔn)、精密度、定性方法、定量方法、回收率、回收率校正、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[10]、相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)、重復(fù)性、重現(xiàn)性[11]、耐用性、篩查方法、篩查目標(biāo)濃度、選擇性、單一實(shí)驗(yàn)室研究或內(nèi)部驗(yàn)證、標(biāo)準(zhǔn)加入法、標(biāo)準(zhǔn)被分析物、物質(zhì)、試驗(yàn)部分、正確度、單位、驗(yàn)證[12]、實(shí)驗(yàn)室間重現(xiàn)性或中等精度/內(nèi)部重現(xiàn)性等。

實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、分析結(jié)果解釋以及采樣方法等內(nèi)容，世界各國(guó)都有各自相應(yīng)的法規(guī)文件規(guī)定，這里不再一一表述。本文重點(diǎn)介紹(EU)2021/808中動(dòng)物性食品等產(chǎn)品中藥物殘留分析常用的篩查方法和確證方法的性能要求。

2 篩查方法的性能要求

篩查方法包括生物、生化或理化篩查方法，包括用作篩查的定性、半定量或定量方法。

對(duì)于禁用或未批準(zhǔn)用藥物，篩查時(shí)的檢測(cè)能力(CCβ)應(yīng)盡可能低，在任何情況下，CCβ都應(yīng)低于(EU)2019/1871規(guī)定的已建立行動(dòng)參考點(diǎn)藥物的行動(dòng)參考點(diǎn)(reference point of action，RPA)。對(duì)于批準(zhǔn)用藥物，CCβ應(yīng)低于MRL(maximum residue limit)或ML(maximum level)。只有能夠以文件可追溯的方式證明經(jīng)過(guò)了驗(yàn)證且假陰性率(β誤差)小于或等于5%的分析方法才能用于篩查。如果出現(xiàn)可疑的陽(yáng)性結(jié)果，則應(yīng)通過(guò)確證方法進(jìn)行確證。

用于篩查或確證的定量篩查方法應(yīng)滿足下面3.2項(xiàng)的準(zhǔn)確度和精密度要求。

3 確證方法的性能要求

3.1 確證方法的一般要求 對(duì)于禁用或未批準(zhǔn)用藥物，CCα應(yīng)盡可能低。(EU)2019/1871規(guī)定了RPA的禁用或未批準(zhǔn)用藥物，CCα應(yīng)小于或等于相應(yīng)的RPA。對(duì)于批準(zhǔn)用藥物，CCα應(yīng)大于但盡可能接近MRL或ML。只有能夠以文件可追溯的方式證明經(jīng)過(guò)了驗(yàn)證且假陽(yáng)性率(α誤差)對(duì)于禁用或未批準(zhǔn)用藥物小于或等于1%，批準(zhǔn)用藥物小于或等于5%的分析方法，才能用于確證。

確證方法應(yīng)提供分析物的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。因此，僅基于色譜分析而不使用質(zhì)譜檢測(cè)的確證方法不適合用作禁用或未批準(zhǔn)用藥物的確證方法。對(duì)于批準(zhǔn)用藥物，在質(zhì)譜法不適用時(shí)，可以使用其他方法，如HPLC-DAD法和HPLC-FLD法或它們的組合。

使用確證方法時(shí)，在提取步驟開始前，應(yīng)添加適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物。根據(jù)可用性，應(yīng)使用特別適用于質(zhì)譜檢測(cè)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記形式的分析物，或與分析物在結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)的類似化合物。當(dāng)沒(méi)有合適的內(nèi)標(biāo)物時(shí)，分析物的鑒別最好通過(guò)共色譜法進(jìn)行確認(rèn)。在這種情況下，只能獲得一個(gè)峰，增強(qiáng)的峰高(或面積)相當(dāng)于添加的分析物的量。如果不可行，則應(yīng)使用基質(zhì)匹配或基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 確證方法的通用性能要求 準(zhǔn)確度(accuracy)是指檢測(cè)結(jié)果與公認(rèn)的真實(shí)參考值之間的接近程度，通過(guò)正確度和精密度來(lái)確定。正確度(trueness)是指從一系列測(cè)試結(jié)果中獲得的平均值與公認(rèn)的參考值之間的一致程度。精密度(precision)是指在規(guī)定條件下獲得的獨(dú)立測(cè)試結(jié)果之間的一致程度，以測(cè)試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)表示。

3.2.1 正確度(trueness) 對(duì)于有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的重復(fù)分析，實(shí)驗(yàn)確定的回收率校正平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)與標(biāo)準(zhǔn)值的偏差應(yīng)符合表1的最小正確度范圍。當(dāng)沒(méi)有合適的CRM時(shí)，可以通過(guò)其他方式評(píng)估測(cè)量的正確度，例如使用具有實(shí)驗(yàn)室間研究指定值的物質(zhì)或使用已知量的分析物添加到空白基質(zhì)中來(lái)進(jìn)行評(píng)估。

表1 定量方法的最小正確度Tab 1 Minimum trueness of quantitative methods

3.2.2 精密度(precision) 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)或添加物質(zhì)進(jìn)行重復(fù)分析的變異系數(shù)(CV)不得超過(guò)Horwitz方程計(jì)算的水平。對(duì)于小于120 μg/kg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，應(yīng)用 Horwitz 方程會(huì)產(chǎn)生不可接受的高值。因此，允許的最大變異系數(shù)不應(yīng)大于表2中的值。在重復(fù)性條件下進(jìn)行的分析其變異系數(shù)應(yīng)小于或等于表2所列值的三分之二。

表2 可接受的變異系數(shù)Tab 2 Acceptable coefficient of variation

3.2.3 色譜分離要求 對(duì)于液相色譜法(liquid chromatography，LC)或氣相色譜法(gas chromatography，GC)，分析物的最小可接受保留時(shí)間應(yīng)為色譜柱死體積保留時(shí)間的兩倍。分析物在提取物中的保留時(shí)間應(yīng)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)或基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間一致，偏差為±0.1 min。對(duì)于保留時(shí)間小于2 min的快速色譜，保留時(shí)間的偏差小于5%。如果使用內(nèi)標(biāo)，分析物的保留時(shí)間與內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間之比(即分析物的相對(duì)保留時(shí)間)，應(yīng)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)或基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)保留時(shí)間一致，GC法的最大偏差為0.5%，LC法的最大偏差為1%。

3.3 質(zhì)譜分析的特殊性能標(biāo)準(zhǔn)和其他要求

3.3.1 質(zhì)譜檢測(cè) 質(zhì)譜檢測(cè)應(yīng)使用下列方式進(jìn)行：(1)全掃描(full scan，F(xiàn)S)；(2)選擇離子監(jiān)測(cè)(selected ion monitoring，SIM)；(3)串聯(lián)質(zhì)譜(MSn)技術(shù)，如選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(selected reaction monitoring，SRM)；(4)質(zhì)譜(MS)或串聯(lián)質(zhì)譜(MSn)技術(shù)與適當(dāng)電離模式的組合。低分辨率質(zhì)譜(low-resolution mass spectrometry，LRMS，單位質(zhì)量分辨率)和高分辨率質(zhì)譜(high-resolution mass spectrometry，HRMS)，包括如雙聚焦、飛行時(shí)間(time of flight，TOF)和軌道阱質(zhì)譜都是合適的。

在使用高分辨率質(zhì)譜(HRMS)確證分析物時(shí)，所有診斷離子的質(zhì)量偏差應(yīng)小于5 ppm(或在m/z<200時(shí)低于1 mDa)。同時(shí)，應(yīng)選擇合適的有效分辨率，并且對(duì)于整個(gè)質(zhì)量范圍在10%峰谷處的分辨率通常應(yīng)大于10000或半峰全寬(FWHM)處大于20000。

質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)前體離子(precursor ion)應(yīng)為準(zhǔn)分子離子、分子離子的特征加合物、特征產(chǎn)物離子或其中一種同位素離子。非選擇性的碎片或產(chǎn)物離子(如失水離子)應(yīng)盡可能不選。選用的特征離子的信噪比(S/N)≥3。待確證分析物的離子相對(duì)豐度應(yīng)與在相同條件下濃度相當(dāng)?shù)幕|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)、基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對(duì)豐度一致，偏差在±40%以內(nèi)。

3.3.2 鑒別(identification) 應(yīng)使用鑒別點(diǎn)系統(tǒng)選擇適當(dāng)?shù)牟杉Ｊ胶驮u(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。為了確證基質(zhì)中已有MRL的藥物，至少需要4個(gè)鑒別點(diǎn)(identification points，IP)；對(duì)于禁用或未批準(zhǔn)用藥物，需要5個(gè)鑒別點(diǎn)(IP)，其中一個(gè)鑒別點(diǎn)須來(lái)自色譜分離。

所有質(zhì)譜法都應(yīng)與一種色譜分離技術(shù)相結(jié)合，適合的分離技術(shù)包括液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)和超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography，SFC)。如果分析物含有同分異構(gòu)體化合物，保留時(shí)間的可接受性(即GC法為±0.5%，LC法和SFC法為±1%)是確證其存在的強(qiáng)制性要求。

表3所示為每種技術(shù)產(chǎn)生的鑒別點(diǎn)。為了獲得確證分析所需的鑒別點(diǎn)，通過(guò)不同技術(shù)獲得的鑒別點(diǎn)可以加和，最多可以組合三種單獨(dú)的技術(shù)來(lái)滿足最少鑒別點(diǎn)。不同的電離模式(例如電子電離和化學(xué)電離)被認(rèn)為是不同的技術(shù)。表4給出了特定技術(shù)和技術(shù)組合得到鑒別點(diǎn)的示例。

表3 每種技術(shù)的鑒別點(diǎn)(IP)Tab 3 Identification points per technique

表4 特定技術(shù)和技術(shù)組合得到鑒別點(diǎn)的示例(n=整數(shù))Tab 4 Examples of the number of identification points specific techniques and combinations of techniques (n=an integer)

3.4 質(zhì)譜以外的檢測(cè)技術(shù)特殊性能要求 僅對(duì)于批準(zhǔn)用藥物而言，下列技術(shù)可用作質(zhì)譜法的替代方法，但須符合這些技術(shù)的相關(guān)要求：(1)全掃描二極管陣列檢測(cè)分光光度法(diode array detection spectrophotometry，DAD)與HPLC一起使用；(2)熒光檢測(cè)分光光度法(fluorescence detection spectrophotometry，F(xiàn)LD)與HPLC一起使用。具有UV/VIS檢測(cè)器(單波長(zhǎng))的液相色譜本身不適合用作確證方法。

3.4.1 全掃描二極管陣列分光光度法的性能標(biāo)準(zhǔn) 除了滿足色譜分離性能標(biāo)準(zhǔn)之外，分析物的紫外最大吸收應(yīng)與基質(zhì)中校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的波長(zhǎng)在最大允許范圍內(nèi)保持一致，最大允許范圍由檢測(cè)系統(tǒng)的分辨率決定。對(duì)于DAD，最大波長(zhǎng)范圍通常在±2 nm以內(nèi)。如果兩個(gè)光譜比較中存在相對(duì)吸光度大于或等于10%的時(shí)候，那么在220 nm以上的分析物的光譜應(yīng)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的光譜不應(yīng)有明顯差異。

當(dāng)二者最大吸收波長(zhǎng)相同，且兩個(gè)光譜之間的差異不大于校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)吸光度的10%，則認(rèn)定被分析物滿足標(biāo)準(zhǔn)。在使用計(jì)算機(jī)搜索和匹配譜庫(kù)時(shí)，樣品中的光譜數(shù)據(jù)與校準(zhǔn)溶液的光譜數(shù)據(jù)比較必須超過(guò)臨界匹配因子，該臨界因子應(yīng)在每個(gè)分析物的驗(yàn)證過(guò)程中根據(jù)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的光譜來(lái)確定。驗(yàn)證過(guò)程中，還應(yīng)檢查由樣品基質(zhì)和檢測(cè)器性能引起的光譜變化。

3.4.2 熒光檢測(cè)分光光度法性能標(biāo)準(zhǔn) 除了滿足色譜分離性能要求之外，結(jié)合色譜條件選擇激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)盡量減少空白樣品提取液中干擾成分的影響。在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)之間應(yīng)該至少有50 nm的距離。色譜圖中最近的最強(qiáng)峰應(yīng)與指定的分析物峰至少相距一個(gè)分析物最大峰高10%處的全峰寬。此規(guī)定適用于具有天然熒光和在轉(zhuǎn)化或衍生化后表現(xiàn)出熒光的分子的測(cè)定。

4 結(jié)束語(yǔ)

目前，國(guó)內(nèi)獸藥殘留檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制修訂以及檢驗(yàn)檢測(cè)任務(wù)的實(shí)施等工作中分析方法的性能要求都以歐盟法規(guī)2002/657/EC為基礎(chǔ)，其中色譜分離保留時(shí)間、離子鑒別點(diǎn)數(shù)要求、定性離子相對(duì)豐度等重要定性依據(jù)更是照搬歐盟這一法規(guī)。但歐盟法規(guī)2002/657/EC已于2021年廢除，新發(fā)布的歐盟法規(guī)2021/808對(duì)色譜分離保留時(shí)間、離子鑒別點(diǎn)數(shù)要求、定性離子相對(duì)豐度等進(jìn)行了修改，變得更加科學(xué)，更易操作，因此，對(duì)國(guó)內(nèi)相關(guān)工作的開展具有很強(qiáng)的借鑒意義。