宋士良

(上海邦成生物工程有限公司，上海 201506)

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)，1900年首先從嬰兒糞便中分離出來(lái)，當(dāng)時(shí)被命名為嗜酸芽孢桿菌(Bacillusacidophilus)。1970年經(jīng)Hanson和Moquot重新鑒定、分類后，修改為現(xiàn)在的名稱，屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性桿菌。國(guó)外專家稱它是GRAS，即公認(rèn)安全的食品微生物[1]。嗜酸乳桿菌是少數(shù)可以存活并定植于人或動(dòng)物腸道內(nèi)的益生菌之一，其在腸道內(nèi)的定植能力強(qiáng)于其它微生物。它能競(jìng)爭(zhēng)性地定植于小腸上皮細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)菌素和有機(jī)酸，維持腸道內(nèi)低pH環(huán)境，促進(jìn)腸道中微生態(tài)環(huán)境的正?；痆2]。趙臣等[3]測(cè)定了一株豬源嗜酸乳桿菌的體外生物學(xué)特性。采用試劑盒法測(cè)定了該菌株的產(chǎn)酸力和抗氧化性能；采用瓊脂平板擴(kuò)散法檢測(cè)了該菌株的抑菌特性；使用豬腸上皮細(xì)胞測(cè)定了該菌株的黏附性能。Matthew等[4]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌在雞體內(nèi)大量存在，能利用各種碳源生長(zhǎng)，耐膽汁、耐酸，能在pH3.00的環(huán)境下，存活5 h；代謝乳糖，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，生物合成乳酸。嗜酸乳桿菌作為動(dòng)物腸道中重要的益生菌，具有維護(hù)動(dòng)物腸道健康、緩解不良應(yīng)激、改善飼養(yǎng)環(huán)境、調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝和改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)等功能[5]。嗜酸乳桿菌La-0231來(lái)源于豬腸道，經(jīng)測(cè)定其耐酸、耐膽鹽能力強(qiáng)。研究的目的是為了優(yōu)化其菌粉生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 嗜酸乳桿菌，由本公司分離自豬腸道，保藏菌株號(hào)La-0231。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體斜面培養(yǎng)基(MRS)：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母浸膏5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，1 mL/L吐溫80，瓊脂18 g/L(液體MRS培養(yǎng)基不加瓊脂)，pH6.20～6.40。種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉浸粉10 g/L，酵母浸膏5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，K2HPO42 g/L，CaCl21 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，1 mL/L吐溫80。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉10 g/L，酵母浸膏5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，K2HPO42 g/L，CaCl21 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，1 mL/L吐溫80；豆粕水解物6.00 g/L；復(fù)合氨基酸0.25 g/L(異亮氨酸0.05 g/L、半胱氨酸0.05 g/L、天門(mén)冬氨酸0.05 g/L、丙氨酸0.05 g/L、賴氨酸0.05 g/L)。以上培養(yǎng)基均經(jīng)118 ℃滅菌20 min處理。復(fù)合氨基酸裝玻璃三角瓶，115 ℃滅菌15 min，單獨(dú)滅菌處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)方法

1.2.1.1 菌種活化培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的斜面菌種接種于活化管種子培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜止培養(yǎng)11 h～15 h。

1.2.1.2 一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng) 按2%接種量將活化種子液轉(zhuǎn)接至裝液量為200 mL/250 mL三角瓶的種子培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜止培養(yǎng)8 h～12 h。

1.2.2 優(yōu)化培養(yǎng)試驗(yàn)方法

1.2.2.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 試驗(yàn)選取33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃四個(gè)溫度，采用種子培養(yǎng)基，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)方法，培養(yǎng)18 h后，取發(fā)酵菌液，測(cè)定菌液的pH、OD600 nm和CFU/mL值。

1.2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 試驗(yàn)選取10 h、14 h、18 h、22 h和26 h五個(gè)培養(yǎng)時(shí)間，采用種子培養(yǎng)基，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)方法，培養(yǎng)不同時(shí)間，取發(fā)酵菌液，測(cè)定菌液的pH、OD600 nm和CFU/mL值。

1.2.2.3 培養(yǎng)基起始pH的優(yōu)化 將種子培養(yǎng)基起始pH值分別調(diào)整至5.40、5.80、6.20和6.80，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)方法，培養(yǎng)18 h，取發(fā)酵菌液，測(cè)定菌液的pH、OD600 nm和CFU/mL值。

1.2.2.4 培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基起始pH值的優(yōu)化組合 采用發(fā)酵培養(yǎng)基，一級(jí)搖瓶培養(yǎng)方法，L9(34)正交試驗(yàn)，測(cè)定各試驗(yàn)號(hào)發(fā)酵菌液的CFU/mL值。

1.2.3 5噸生產(chǎn)罐發(fā)酵試驗(yàn)方法

1.2.3.1 二級(jí)搖瓶種子培養(yǎng) 按2%接種量將一級(jí)搖瓶種子液轉(zhuǎn)接至裝液量為2000 mL/3000 mL三角瓶的種子培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜止培養(yǎng)10 h～14 h。

1.2.3.2 種子罐培養(yǎng) 50 L培養(yǎng)基配制及滅菌：將種子培養(yǎng)基原料準(zhǔn)確稱量后置于約30 L配料桶中，加入約20 L凈化水，攪拌溶解后過(guò)200目濾布添加到種子罐中，將沖洗配料桶的凈化水過(guò)200目濾布倒入種子罐中，并補(bǔ)水至罐體適宜容量(95%±5%)，80 r/min攪拌5 min，進(jìn)行滅菌處理。50 L種子罐培養(yǎng)條件：接種量4%，接種后維持罐壓0.02Mpa～0.04 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速80 min，培養(yǎng)時(shí)間8 h～10 h。

1.2.3.3 發(fā)酵罐發(fā)酵 5噸發(fā)酵培養(yǎng)基配制及滅菌：①首先向配料罐中通入約4噸凈化水，打開(kāi)蒸汽閥，使配料罐中的水溫維持在40 ℃～60 ℃，打開(kāi)攪拌機(jī)進(jìn)行攪拌溶解；將發(fā)酵培養(yǎng)基原料準(zhǔn)確稱量后添加到配料罐中進(jìn)行溶解，時(shí)間約為10 min；待物料完全溶解后，打開(kāi)輸送泵，將料液經(jīng)200目過(guò)濾器輸送至發(fā)酵罐中。然后在配料罐中加入適量?jī)艋逑磁淞瞎蓿瑢⑶逑春蟮乃?jīng)200目過(guò)濾器輸送至發(fā)酵罐中(水量保證滅菌后加入復(fù)合氨基酸溶液和接種種子液后的終體積在4500L±100L)。②復(fù)合氨基酸配制及滅菌：向備用100升種子罐中注入凈化水至罐體容量的90%(保證復(fù)合氨基酸溶液滅菌后體積在100L±10L)，先對(duì)凈化水進(jìn)行121 ℃20 min滅菌處理，滅菌后降溫至60 ℃以下，將復(fù)合氨基酸準(zhǔn)確稱量后投入滅過(guò)菌的凈化水中，攪拌均勻充分溶解后，對(duì)復(fù)合氨基酸溶液進(jìn)行115 ℃ 10 min滅菌處理，滅菌結(jié)束后降溫至室溫備用。③氫氧化鈉溶液配制及滅菌：先打開(kāi)進(jìn)凈化水水閥，向350升補(bǔ)堿罐中注入適量?jī)艋?，稱取適量氫氧化鈉，緩慢倒入350L補(bǔ)堿罐中，充分溶解。配制結(jié)束后，向罐內(nèi)通入蒸汽，滅菌壓力控制在0.05 Mpa～0.10Mpa，時(shí)間15 min，然后關(guān)閉蒸汽進(jìn)氣閥，夾層通入冷卻水，降溫至40±1 ℃，自然冷卻待發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)初始pH。5噸發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：接種量2%，接種后維持罐壓0.02Mpa～0.04 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速80 min。

1.2.3.4 流加氫氧化鈉溶液發(fā)酵試驗(yàn)方法 試驗(yàn)選取流加15%、25%、35%三個(gè)濃度的氫氧化鈉溶液進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，同時(shí)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的pH、OD600 nm和CFU/mL值，以確定最佳的氫氧化鈉溶液流加濃度和停罐發(fā)酵時(shí)間。

1.2.4 離心參數(shù)的確定試驗(yàn)方法 試驗(yàn)采用管式離心機(jī)離心收集菌泥，試驗(yàn)選144、180、216、252和288L/h五個(gè)流量值進(jìn)行離心，在菌泥收得率和菌體存活率之間找到一個(gè)平衡點(diǎn)，以最大限度地收得到高活菌存活率的菌泥。

1.2.5 凍干參數(shù)的確定試驗(yàn)方法

1.2.5.1 菌泥乳化方法 在300L乳化罐中加入適量?jī)艋?，?zhǔn)確稱取凍干保護(hù)劑各組分(按1 kg菌泥添加脫脂奶粉195 g、海藻糖75 g、蔗糖57 g、甘露醇40 g、甘油30 g配制固體保護(hù)劑)，按各組分先后程序分別稱取并倒入乳化罐中，開(kāi)啟攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速80 min，待固體保護(hù)劑成分充分溶解后，補(bǔ)足水量，在乳化罐夾套中通入蒸汽進(jìn)行加溫滅菌，滅菌料溫維持在115 ℃～118 ℃，時(shí)間15 min。滅菌后通冷凝水進(jìn)行降溫，維持罐內(nèi)料溫4 ℃～8 ℃，加入離心收集的菌泥，菌泥：液體保護(hù)劑(固體保護(hù)劑+水)=1∶2，乳化時(shí)間5 min～10 min。

1.2.5.2 預(yù)凍溫度的確定試驗(yàn)方法 將乳化后的料液裝入托盤(pán)，控制物料厚度在8 mm～12 mm之間，放入凍干倉(cāng)，進(jìn)行冷凍干燥。預(yù)凍對(duì)菌體在凍干過(guò)程中的存活率有重要影響，試驗(yàn)設(shè)預(yù)凍溫度為-30 ℃、-35 ℃、-40 ℃、-45 ℃和-50 ℃五個(gè)溫度值，預(yù)凍1 h，凍干過(guò)程物料倉(cāng)的真空度40 Pa，測(cè)定凍干菌粉的CFU/g值和水分含量。

1.2.5.3 真空度的確定試驗(yàn)方法 在凍干過(guò)程中，物料倉(cāng)的真空度是個(gè)重要的參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)真空度為30 Pa、40 Pa、50 Pa和60 Pa四個(gè)值，測(cè)定其對(duì)凍干菌粉的CFU/g值和水分含量的影響。

1.2.6 凍干菌粉耐受性測(cè)定方法

1.2.6.1 酸耐受性測(cè)試方法 稱取4 g待測(cè)凍干菌粉溶解于36 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻制成菌懸液。吸取0.5 mL菌懸液至裝有4.5 mL無(wú)菌生理鹽水試管中，充分混勻，制成10-2稀釋度菌懸液，以此方法制備10-3～10-10稀釋度菌懸液，用平板傾注法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。吸取0.5 mL菌懸液至4.5 mL已經(jīng)滅菌處理的 MRS液體培養(yǎng)基(用鹽酸調(diào)節(jié)pH3.00)試管中，充分混勻，制備10-2稀釋度菌懸液，以此方法制備3支10-3稀釋度菌懸液，置于37 ℃水浴中；分別在1 h、2 h和4 h時(shí)取出，用生理鹽水稀釋后，平板傾注法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以用無(wú)菌生理鹽水稀釋的菌懸液活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果作為空白對(duì)照(0 h)。統(tǒng)計(jì)經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基(pH3.00)處理1 h、2 h和4 h后的菌懸液活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果，以處理時(shí)間作為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果作為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.2.6.2 膽鹽耐受性測(cè)試方法 稱取4 g待測(cè)凍干菌粉溶解于36 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻制成菌懸液。吸取0.5 mL菌懸液至裝有4.5 mL無(wú)菌生理鹽水試管中，充分混勻，制成10-2稀釋度菌懸液，以此方法制備10-3～10-10稀釋度菌懸液，用平板傾注法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。分別稱取4 g待測(cè)凍干菌粉溶解于36 mL濃度為0.20%和0.30%的豬膽鹽試劑瓶中，充分混勻，置于37 ℃水浴中；分別在1 h、2 h和4 h時(shí)取出，用生理鹽水稀釋后，平板傾注法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以用無(wú)菌生理鹽水稀釋的菌懸液活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果作為空白對(duì)照(0 h)。統(tǒng)計(jì)經(jīng)不同豬膽鹽濃度處理1 h、2 h和4 h后的菌懸液活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果，以處理時(shí)間作為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果作為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 OD600 nm值的測(cè)定方法 用752 N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，用蒸餾水作空白。

1.3.2 pH值的測(cè)定方法 按照GB/T 6920規(guī)定的方法測(cè)定。

1.3.3 活菌數(shù)的測(cè)定方法 按照GB/T 20191規(guī)定的方法測(cè)定。

1.3.4 水分的測(cè)定方法 按照GB/T 6435規(guī)定的方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化培養(yǎng)試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 嗜酸乳桿菌La-0231在37 ℃下培養(yǎng)，菌液中的活菌數(shù)最高達(dá)到(8.62±0.14)×108CFU/mL，顯著高于其它培養(yǎng)溫度(P<0.05)；此時(shí)OD600 nm值也最高為(2.91±0.13)，pH值為(4.51±0.13)(表1)。

表1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Optimized results of culture temperature

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 培養(yǎng)時(shí)間為18 h時(shí)，菌液中的活菌數(shù)最高達(dá)到(8.11±0.47)×108CFU/mL，顯著高于其它培養(yǎng)時(shí)間(P<0.05)；此時(shí)OD600 nm值也最高為(3.07±0.16)，pH值為(4.49±0.31)(表2)。

表2 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Optimized results of culture time

2.1.3 培養(yǎng)基起始pH的優(yōu)化 培養(yǎng)基起始pH值為6.20時(shí)，菌液中的活菌數(shù)最高達(dá)到(16.00±0.14)×108CFU/mL，顯著高于其它培養(yǎng)基起始pH值(P<0.05)；此時(shí)OD600 nm值也最高為(3.22±0.18)，pH值為(4.35±0.25)(表3)。

表3 培養(yǎng)基起始pH的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Optimized results of initial pH of culture medium

2.1.4 培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基起始pH值的優(yōu)化組合 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果，實(shí)際最佳組合和理論最佳組合一致，均為正交表的試驗(yàn)號(hào)5(A2B2C3)，結(jié)果值為4.42×109CFU/mL(表4)。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of L9(34) orthogonal experiment

因此，嗜酸乳桿菌La-0231發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)基初始pH值6.40、培養(yǎng)時(shí)間18 h，并為下一步5噸生產(chǎn)罐發(fā)酵參數(shù)的確定提供了試驗(yàn)依據(jù)。

2.2 5噸生產(chǎn)罐發(fā)酵參數(shù)的確定 嗜酸乳桿菌La-0231在發(fā)酵的過(guò)程中會(huì)不斷的產(chǎn)生乳酸，乳酸的不斷積累會(huì)使pH值持續(xù)下降，這對(duì)于高密度發(fā)酵菌體的積累很不利。因此，5噸生產(chǎn)罐發(fā)酵參數(shù)中pH控制和發(fā)酵終點(diǎn)(發(fā)酵時(shí)間)判定極為重要。圖1為37 ℃、pH自然條件下發(fā)酵過(guò)程O(píng)D600 nm和pH值測(cè)定曲線。

圖1 37 ℃、pH自然條件下發(fā)酵過(guò)程O(píng)D600 nm和pH值測(cè)定曲線Fig 1 Fermentation process OD600 nm and pH determinationcurve at 37 ℃ and pH under natural conditions

當(dāng)發(fā)酵液的pH值第一次達(dá)到4.90時(shí)，流加一定量的氫氧化鈉溶液，使pH值回升到5.20，停止流加，如此反復(fù)兩次，菌體在不受低酸度抑制的情況下實(shí)現(xiàn)大量累積。發(fā)酵溫度37 ℃，流加15%濃度氫氧化鈉溶液發(fā)酵17 h，發(fā)酵液的活菌數(shù)達(dá)到最高為(18.62±1.05)×108CFU/mL，顯著高于發(fā)酵16 h、18 h(P<0.05)；流加25%濃度氫氧化鈉溶液發(fā)酵16～17 h，發(fā)酵液的活菌數(shù)達(dá)到最高為(63.11±2.23)×108～(68.01±3.08)×108CFU/mL，顯著高于發(fā)酵15 h、18 h(P<0.05)，發(fā)酵16 h～17 h之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；流加35%濃度氫氧化鈉溶液發(fā)酵16 h，發(fā)酵液的活菌數(shù)達(dá)到最高為(20.12±1.13)×108CFU/mL，顯著高于發(fā)酵15 h、17 h(P<0.05)(表5)。

表5中，流加15%、25%、35%濃度氫氧化鈉溶液發(fā)酵液活菌數(shù)最高值比較，流加25%濃度氫氧化鈉溶液發(fā)酵液的活菌數(shù)為最高，達(dá)到(68.01±3.08)×108CFU/mL，顯著高于流加15%、35%濃度氫氧化鈉溶液(P<0.05)。

表5 流加不同濃度氫氧化鈉溶液發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of fed-batch fermentation with different concentrations of sodium hydroxide

所以，嗜酸乳桿菌La-0231菌株5噸生產(chǎn)罐最佳發(fā)酵控制參數(shù)為：發(fā)酵溫度37 ℃，培養(yǎng)基初始pH值為6.40，氫氧化鈉的流加濃度為25%，發(fā)酵時(shí)間為16 h，發(fā)酵液最終pH值范圍在4.20～4.80之間，OD600 nm值在6.00以上，活菌數(shù)為6.80×109CFU/mL。

2.3 離心參數(shù)的確定 發(fā)酵液在離心過(guò)程中，流量的大小決定離心所用的時(shí)間和菌泥的收得率，同時(shí)離心過(guò)程由于離心力的作用，會(huì)對(duì)菌體有一定的損傷。離心時(shí)的流量為216 L/h時(shí)，在每升發(fā)酵液獲得(10.32±0.67) g較高菌泥收率的情況下，菌泥活菌數(shù)含量最高為(7.02±0.23)×1011CFU/g，顯著高于其它流量指標(biāo)(P<0.05)，計(jì)算總活菌數(shù)為7.24×1012CFU/g(表6)。

2.4 凍干參數(shù)的確定 預(yù)凍溫度在-45 ℃～-50 ℃的條件下，凍干菌粉的活菌數(shù)含量最高達(dá)到(3.61±0.13)×1011～(3.97±0.08)×1011CFU/g，顯著高于其它預(yù)凍溫度(P<0.05)，預(yù)凍溫度-45 ℃～-50 ℃之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；此時(shí)水分含量為(3.10±0.31)%～(3.22±0.14)%(表7)。

表7 預(yù)凍溫度對(duì)凍干菌粉的活菌數(shù)和水分含量的影響Tab 7 Effects of prefreezing temperature on viable bacteria count and moisture content of freeze-dried powder

50 Pa的真空度對(duì)凍干菌粉活菌數(shù)含量的影響最小，凍干菌粉活菌數(shù)含量最高為(4.56±0.14)×1011CFU/g，顯著高于其它真空度(P<0.05)；凍干菌粉水分含量為(3.19±0.14)%(表8)。

表8 真空度對(duì)凍干菌粉的活菌數(shù)和水分含量的影響Tab 8 Effects of vacuum degree on viable bacteria count and moisture content of freeze-dried powder

2.5 凍干菌粉耐受性測(cè)定

2.5.1 對(duì)酸的耐受性測(cè)試 嗜酸乳桿菌La-0231在pH3.00的MRS液體培養(yǎng)基中處理0～1 h，活菌數(shù)從(2.31±0.06)×1011CFU/g降至(1.91±0.06)×1011CFU/g(P<0.05)，存活率為82.68%；處理 0～2 h，活菌數(shù)從(2.31±0.06)×1011CFU/g降為(1.82±0.07)×1011CFU/g(P<0.05)，存活率為78.79%；處理0 h～4 h，活菌數(shù)從(2.31±0.06)×1011CFU/g降為(1.31±0.04)×1011CFU/g(P<0.05)，存活率為56.71%(圖2)。

圖2 活菌數(shù)隨處理時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig 2 The changing trend of viable bacterial count with treatment time

2.5.2 對(duì)膽鹽耐受性的測(cè)試 嗜酸乳桿菌La-0231在0.20%濃度的豬膽鹽溶液中處理0 h～1 h，活菌數(shù)從(1.23±0.06)×1011CFU/g降至(1.08±0.06)×1010CFU/g(P>0.05)，存活率為87.80%；處理0 h～2 h，活菌數(shù)從(1.23±0.06)×1011CFU/g降為(1.08±0.06)×1010CFU/g(P>0.05)，存活率為87.80%；處理0 h～4 h，活菌數(shù)從(1.23±0.06)×1011CFU/g降為(1.01±0.06)×1010CFU/g(P>0.05)，存活率為82.11%。在0.30%濃度的豬膽鹽溶液中處理0 h～1 h，活菌數(shù)從(1.23±0.06)×1011CFU/g降至為(0.74±003)×1010CFU/g(P<0.05)，存活率為60.16%；處理0 h～2 h，活菌數(shù)從(1.23±0.06)×1011CFU/g降為(0.70±0.04)×1010CFU/g(P<0.05)，存活率為56.91%；處理0 h～4 h，活菌數(shù)從(1.23±0.06)×1011CFU/g降為(0.70±0.04)×1010CFU/g(P<0.05)，存活率為56.91%(圖3)。

圖3 活菌數(shù)隨處理時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig 3 The changing trend of viable bacterial count with treatment time

3 討論與結(jié)論

陳齊等采用分離自人體腸道的一株嗜酸乳桿菌LA-G80，通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化獲得其最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為葡萄糖41.5 g/L、麥芽糖20 g/L、牛肉浸粉18.64 g/L、蛋白胨15 g/L、胰蛋白胨10 g/L、大豆低聚糖10 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、MnSO4·4H2O 0.05 g/L、1 mL/L吐溫-80；添加豆餅粉7.43 g/L、花生蛋白粉5.43 g/L、天門(mén)冬氨酸0.16 g/L、丙氨酸0.16 g/L、絲氨酸0.16 g/L作增殖因子。最佳發(fā)酵條件為接種量2%、恒溫37 ℃、培養(yǎng)基初始pH6.00、恒定pH5.50厭氧發(fā)酵，發(fā)酵液最高活菌數(shù)4.22×109CFU/mL；相比較MRS發(fā)酵培養(yǎng)基活菌數(shù)提高約9倍[6]。趙燕霞等采用分離自新疆傳統(tǒng)酸馬奶中的一株嗜酸乳桿菌IMAU30067，通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)以及響應(yīng)面法優(yōu)化得到其最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為葡萄糖30.00 g/L、麥芽糖30.00 g/L、魚(yú)蛋白胨30.00 g/L、海藻糖20.00 g/L、大豆蛋白胨10.00 g/L、乙酸鈉5.74 g/L、檸檬酸鈉2.29 g/L、K2HPO42.29 g/L、MgSO4·7H2O 0.80 g/L；添加馬鈴薯提取物6.00 g/L、組氨酸0.10 g/L作增殖因子。最佳發(fā)酵條件為接種量1×106CFU/mL、初始pH值6.50，于37 ℃恒pH5.00厭氧發(fā)酵，發(fā)酵液最高活菌數(shù)3.72×109CFU/mL；相比較MRS發(fā)酵培養(yǎng)基活菌數(shù)提高約8倍[7]。張超鳳等采用中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)購(gòu)買(mǎi)的嗜酸乳桿菌菌種，通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得其最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為4°Bx碎米水解液、豆粕(豆粕加水煮沸20 min，過(guò)濾)20 g/L、葡萄糖15 g/L、乙酸鈉5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L；添加白蘿卜汁70 g/L、麥芽汁60 g/L、乳糖9 g/L作增殖因子。最佳發(fā)酵條件為接種量5%、恒溫37 ℃、培養(yǎng)基初始pH5.50～6.00、通5%CO2厭氧發(fā)酵，發(fā)酵液最高活菌數(shù)6.20×109CFU/mL。相比較其最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基活菌數(shù)提高約12倍[8]。

研究以豬源嗜酸乳桿菌La-0231為供試菌株。以葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉10 g/L，酵母浸膏5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，K2HPO42 g/L，CaCl21 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，1 mL/L吐溫80為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(改良MRS培養(yǎng)基)；添加豆粕水解物6.00 g/L、復(fù)合氨基酸0.25 g/L(異亮氨酸0.05 g/L、半胱氨酸0.05 g/L、天門(mén)冬氨酸0.05 g/L、丙氨酸0.05 g/L、賴氨酸0.05 g/L)作增殖因子。與上述陳齊，趙燕霞等采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比較，原料用量少，成本低；與張超鳳等采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和增殖因子相比較，原料處理簡(jiǎn)單，更符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。本研究經(jīng)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化的5噸生產(chǎn)罐發(fā)酵最佳控制參數(shù)為接種量2%、發(fā)酵溫度37 ℃、培養(yǎng)基初始pH值為6.40、流加氫氧化鈉濃度為25%控制發(fā)酵液pH4.90～5.20、發(fā)酵時(shí)間為16 h、發(fā)酵液最終pH值范圍在4.20～4.80之間、OD600 nm值在6.00以上，發(fā)酵液最高活菌數(shù)6.80×109CFU/mL，相比較采用MRS發(fā)酵培養(yǎng)基活菌數(shù)提高約10倍；優(yōu)于上述陳齊、趙燕霞、張超鳳等試驗(yàn)所獲結(jié)果。同時(shí)，與上述陳齊、趙燕霞、張超鳳等試驗(yàn)所獲最佳發(fā)酵條件相比較，培養(yǎng)基初始pH值、控制發(fā)酵過(guò)程發(fā)酵液pH范圍等參數(shù)值有所不同。上述試驗(yàn)結(jié)果比較說(shuō)明，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)不同豬源嗜酸乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝，菌株不同，基礎(chǔ)培養(yǎng)基、添加增殖因子以及最佳發(fā)酵條件也略有不同，本試驗(yàn)結(jié)果僅供參考借鑒。但發(fā)酵過(guò)程37 ℃培養(yǎng)、流加25%濃度氫氧化鈉控制發(fā)酵液pH應(yīng)具有普適性。

本研究發(fā)酵液離心時(shí)的流量設(shè)定值以216 L/h為優(yōu)。確定預(yù)凍溫度為-45 ℃～-50 ℃最佳，冷凍干燥中物料倉(cāng)的真空度設(shè)定以50 Pa較為適宜。離心、凍干工藝優(yōu)化后，凍干菌粉活菌數(shù)含量為4.56×1011CFU/g，水分含量3.19%。與優(yōu)化前凍干菌粉活菌數(shù)含量相比提高約3～5倍。此結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)不同豬源嗜酸乳桿菌離心、凍干工藝，為進(jìn)一步擴(kuò)大豬源嗜酸乳桿菌La-0231菌粉產(chǎn)業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，提供了指導(dǎo)意義。

袁林等采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其增殖培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件，獲得發(fā)酵液的最高活菌數(shù)為4.32×1010CFU/mL[9]。王曉萌等通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)冷凍干燥前的嗜酸乳桿菌進(jìn)行休克處理?xiàng)l件優(yōu)化，再結(jié)合復(fù)合凍干保護(hù)劑，使其冷凍干燥后的存活率提高至96.94%；比未冷休克，添加保護(hù)劑冷凍干燥(78.99%)高出17.65%；比未冷休克，未添加保護(hù)劑冷凍干燥(21.42%)高出75.22%[10]。參比上述試驗(yàn)研究方法，為進(jìn)一步提高豬源嗜酸乳桿菌La-0231發(fā)酵液活菌數(shù)及凍干菌粉活菌含量，采用一些更新的思路、更新的手段優(yōu)化菌粉生產(chǎn)工藝值得借鑒。

經(jīng)耐酸、耐膽鹽性能測(cè)試，顯示豬源嗜酸乳桿菌La-0231具有良好的耐酸、耐膽鹽特性。