劉博 胡金霞 胡陽

肺癌是全球范圍常見的惡性腫瘤，也是死亡率較高的癌癥，每年新增病例約有180萬，死亡人數(shù)高達160萬例[1]。雖然肺癌的治療方法在醫(yī)學(xué)上已經(jīng)取得了明顯效果，但是仍有一些不足出現(xiàn)(5年預(yù)后較差、復(fù)發(fā)性較高等)，仍需要進一步改善[2]。腫瘤惡性增殖、高度侵襲和轉(zhuǎn)移，是惡性腫瘤的生物特征，也是腫瘤復(fù)發(fā)的誘因，對肺癌增殖和轉(zhuǎn)移的研究具有重要意義。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種共價閉合結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA，能夠參與肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過程[3]，如circSATB2在非小細胞肺癌組織和細胞內(nèi)高表達，與肺癌敏感性、轉(zhuǎn)移等有關(guān)，抑制circSATB2能夠降低非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[4]。利用在線生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測顯示miR-382-5p是circSATB2靶基因，研究結(jié)果顯示miR-382-5p在非小細胞肺癌患者血清內(nèi)低表達[5]，過表達miR-382-5p能有效抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞的凋亡[6]。但是關(guān)于circSATB2與miR-382-5p二者的研究尚無明確報道，本研究通過探討circSATB2通過靶向miR-382-5p對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為肺癌的研究提供新的作用靶點。

資料與方法

一、樣本收集

收集25例在本院確診為肺癌患者的癌旁組織和肺癌組織，放置在液氮罐內(nèi)冷凍保存。所有患者在手術(shù)前均未進行任何放療或化療，所有患者均簽署了手術(shù)知情同意書，該研究已經(jīng)獲得本院倫理委員會的批準(批號：HX2020025)。

二、細胞和主要試劑

永生化的支氣管上皮細胞BEAS-2B、肺癌細胞H460、H1299、A549購自美國ATCC公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000試劑盒、Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；si-NC、si-circSATB2、miR-NC、miR-382-5p、anti-miR-NC、anti-miR-382-5p由賽默飛世爾公司設(shè)計合成；引物購自上海吉瑪公司；Prime Script RT Master Mix試劑盒、熒光定量試劑盒、雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega公司；MTT試劑盒購自北京索萊寶公司；Transwell購自美國Corning公司；Matrigel膠購自美國BD公司；Ki67抗體、MMP9抗體、GAPDH公司購自美國Santa Cruz公司。

三、細胞培養(yǎng)和分組

從液氮罐內(nèi)取出永生化的支氣管上皮細胞BEAS-2B、以及肺癌細胞H460、H1299、H1975，復(fù)蘇后在含有10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。當(dāng)細胞匯合率為85%時，取H1299細胞，然后以2×105個接種至6孔板中，利用LipofectamineTM2000將si-NC、si-circSATB2、miR-NC、miR-382-5p轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，記為si-NC組、si-circSATB2組、miR-NC組、miR-382-5p組；將si-circSATB2和anti-miR-NC、si-circSATB2和anti-miR-382-5p共轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，記為si-circSATB2+anti-miR-NC組和si-circSATB2+anti-miR-382-5p組。

四、qRT-PCR檢測circSATB2和miR-382-5p的表達

利用Trizol試劑從肺癌組織、癌旁組織、BEAS-2B細胞、肺癌細胞(H460、H1299、H1975)以及各組H1299細胞中提取總RNA，然后在紫外分光度計下檢測RNA的濃度和純度。然后利用Prime Script RT Master Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒進行PCR反應(yīng)，分別GAPDH和U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法檢測circSATB2和miR-382-5p的表達量。

五、MTT實驗檢測細胞增殖

將各組H1299細胞固定培養(yǎng)48 h、72 h后，按照MTT試劑盒加入新配制的MTT試劑10 μL，然后繼續(xù)反應(yīng)4h，除去上清液，加入150 μL的二甲基亞砜試劑，使結(jié)晶充分溶解，酶標儀490 nm檢測吸光度值。

六、Transwell檢測細胞遷移和侵襲

遷移實驗：收集組的H1299細胞采用無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度，制成2×105個/mL的細胞懸液，在Transwell下室加入500 μL含有血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，上內(nèi)加入100 μL的細胞懸液，培養(yǎng)24 h，取去小室擦掉未遷移的細胞，采用多聚甲醛、結(jié)晶紫固定并進行染色，選擇明亮視野于顯微鏡下觀察細胞遷移數(shù)目。

侵襲實驗：將Matrigel膠按照比例稀釋，并鋪在Transwell上室內(nèi)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，后續(xù)實驗步驟同遷移實驗。

七、Western Blot檢測Ki67、MMP9蛋白表達

利用RIPA試劑裂解各組H1299細胞內(nèi)蛋白，按照BCA法檢測定量蛋白濃度，并配置8%分離膠和12%濃縮膠，取上樣蛋白樣品然后80V跑濃縮膠、120V跑分離膠，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉培養(yǎng)60 min，然后加入稀釋1:500的Ki67、MMP9抗體，4℃過夜孵育，加入稀釋的二抗于室溫下孵育60 min，滴加ECL發(fā)光液顯影、拍照。以GAPDH作為內(nèi)參，利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

八、雙熒光素酶報告實驗

通過在線軟件預(yù)測顯示circSATB2和miR-382-5p存在互補核苷酸序列，然后構(gòu)建miR-382-5p結(jié)合微雕的circSATB2野生型載體(circSATB2 wt)和突變型載體(circSATB2 mut)，按照脂質(zhì)體法與miR-NC或miR-382-5p轉(zhuǎn)染至H1299細胞內(nèi)，細胞轉(zhuǎn)染48 h后，利用雙熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。

九、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果以平均數(shù)?標準差表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、circSATB2和miR-382-5p在肺癌組織中的表達

與癌旁組織相比，肺癌組織能顯著增加circSATB2表達量(P<0.05)，顯著降低miR-382-5p表達量(P<0.05)(見表1)。

表1 circSATB2和miR-382-5p在肺癌組織中的表達

二、circSATB2和miR-382-5p在肺癌細胞中的表達

與永生化的支氣管上皮細胞BEAS-2B相比，肺癌細胞H460、H1299、A549內(nèi)circSATB2表達量顯著增加(P<0.05)，miR-382-5p表達量顯著降低(P<0.05)。本研究選擇差異較大的肺癌細胞H1299進行后續(xù)實驗(見表2)。

表2 circSATB2和miR-382-5p在肺癌細胞中的表達

三、敲低circSATB2對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與si-NC組相比，si-circSATB2組的circSATB2表達量顯著降低(P<0.05)，細胞48 h、72 h的OD值顯著降低(P<0.05)，細胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.05)，Ki67、MMP9蛋白表達顯著降低(P<0.05)(見圖1，表3)。

圖1 敲低circSATB2對肺癌細胞Ki67、MMP9蛋白表達的影響

表3 敲低circSATB2對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

四、circSATB2調(diào)控miR-382-5p的表達

在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示circSATB2和miR-382-5p存在互補的核苷酸序列(見圖2)。通過雙熒光素酶報告實驗進一步驗證兩者間的關(guān)系，結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-382-5p組內(nèi)circSATB2 wt熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，circSATB2 mut熒光素酶活性沒有任何變化(見表4)。

圖2 circSATB2和miR-382-5p互補核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

五、過表達miR-382-5p對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與miR-NC組相比，miR-382-5p組的miR-382-5p表達量顯著增加(P<0.05)，細胞48 h、72 h的OD值顯著降低(P<0.05)，細胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.05)，Ki67、MMP9蛋白表達顯著降低(P<0.05)(見圖3、表5)。

表5 過表達miR-382-5p對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖3 過表達miR-382-5p對肺癌細胞Ki67、MMP-9蛋白表達的影響

六、抑制miR-382-5p部分回復(fù)敲低circSATB2對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與si-circSATB2+anti-miR-NC組相比，si-circSATB2+anti-miR-382-5p組的miR-382-5p表達量顯著降低(P<0.05)，細胞48 h、72 h的OD值顯著增加(P<0.05)，細胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目顯著增加(P<0.05)，Ki67、MMP9蛋白表達顯著增加(P<0.05)(見圖4、表6)。

表6 抑制miR-382-5p部分回復(fù)敲低circSATB2對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 抑制miR-382-5p部分回復(fù)敲低circSATB2對肺癌細胞Ki67、MMP-9蛋白表達的影響

討 論

circRNA既沒有5′帽子也沒有3′聚腺苷酸尾巴，具有高度的穩(wěn)定性，在肺癌中異常表達[7]，有研究結(jié)果通過GEO數(shù)據(jù)研究差異表達circRNA，發(fā)現(xiàn)circ_102231在肺癌組織內(nèi)表達上調(diào)，與晚期TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總體生存率有關(guān)，抑制circ_102231能有效抑制肺癌細胞的增殖和侵襲[8]。Chen等[9]研究結(jié)果顯示，circ_100395在肺癌組織內(nèi)表達下調(diào)，與肺癌患者TNM分期和轉(zhuǎn)移負相關(guān)，患者預(yù)后也較差，過表達circ_100395能顯著抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，阻滯細胞周期，這與本研究結(jié)果相反。Han等[10]研究結(jié)果顯示，在肺癌組織中circ_BANP表達上調(diào)，沉默circ_BANP能抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，通過海綿miR-503發(fā)揮在肺癌中的作用。Zhou等[11]研究結(jié)果顯示，circ_102179在非小細胞肺癌組織和細胞內(nèi)表達上調(diào)，circ_102179通過調(diào)控miR-330-5p/HMGB3軸促進非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。以上實驗均說明circRNA與肺癌密切相關(guān)，可以作為肺癌的潛在標記物，本研究采用qRT-PCR檢測肺癌組織和細胞內(nèi)circSATB2表達變化，結(jié)果顯示，circSATB2在肺癌組織和肺癌細胞H460、H1299、A549內(nèi)表達量增加，說明circSATB2在肺癌中起到促癌的作用，將si-circSATB2轉(zhuǎn)染至H1299內(nèi)，結(jié)果顯示，敲低circSATB2能夠抑制細胞OD值，降低細胞遷移數(shù)目、細胞侵襲數(shù)目，下調(diào)Ki67、MMP9蛋白表達，這說明敲低circSATB2能抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

miR-382-5p已被證明在多種癌癥內(nèi)低表達，如乳腺癌、血管瘤、骨肉瘤等，過表達miR-382-5p能有效抑制癌癥細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡[12-14]。在膠質(zhì)瘤的研究中，過表達miR-382-5p通過靶向調(diào)控PTEN抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。有研究結(jié)果顯示，miR-382-5p在乳腺癌組織和細胞表達下調(diào)，SNHG1通過靶向負調(diào)控miR-382-5p抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[16]。本研究結(jié)果顯示，miR-382-5p在肺癌組織和肺癌細胞H460、H1299、A549內(nèi)表達量降低，過表達miR-382-5p能夠降低細胞OD值，減少細胞遷移數(shù)目、細胞侵襲數(shù)目，Ki67、MMP9蛋白表達下調(diào)，這說明過表達miR-382-5p能抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。circSATB2可以充當(dāng)下游miRNA海綿，在線生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測顯示miR-382-5p是circSATB2靶基因，本研究通過雙熒光素素酶實驗進一步驗證circSATB2和miR-382-5p二者之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)circSATB2能調(diào)控miR-382-5p的表達，抑制miR-382-5p部分回復(fù)敲低circSATB2對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用，說明circSATB2可能通過調(diào)控miR-382-5p的表達發(fā)揮在肺癌中的作用。

綜上所述，circSATB2在肺癌組織和細胞內(nèi)表達上調(diào)，miR-382-5p表達下調(diào)，敲低circSATB2可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與過表達miR-382-5p有關(guān)。