何慧 陳軍 姜蘭

肺癌是我國居民發(fā)病率和死亡率均高居首位的惡性腫瘤[1]，其中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是主要的組織學(xué)類型，約占85%左右[2]。目前，NSCLC早期診斷率低，多數(shù)患者就診時已錯失最佳治療時機(jī)，即使現(xiàn)有診療技術(shù)不斷提高，但對患者預(yù)后改善依然作用有限[3]。因此，有必要尋找與NSCLC病程進(jìn)展相關(guān)基因，以指導(dǎo)患者早期診療。微小RNA(microRNA，miRNA)作為僅含約20nt的短鏈信使RNA，可穩(wěn)定存在于組織中，廣泛參與調(diào)控多項(xiàng)生理病理過程及疾病進(jìn)程[4]，研究表明[5]，腫瘤組織中存在miRNA表達(dá)異常。且參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能[6]。miR-372作為miRNA家族成員，已發(fā)現(xiàn)其參與了前列腺癌[7]、膀胱癌[8]、結(jié)直腸癌[9]等多種腫瘤病理進(jìn)展過程。本研究分析了NSCLC組織中miR-372表達(dá)，探討其臨床意義，以及上調(diào)該基因?qū)549細(xì)胞增殖及侵襲的影響。

資料與方法

一、資料

以2018年3月至2021年3月在我院接受治療的NSCLC患者為對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初治患者，術(shù)前未接受放化療；(2)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)；(3)臨床資料完整，患者或家屬均知情且簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝腎功能嚴(yán)重不全者；(2)合并有肺部急慢性疾患、免疫系統(tǒng)疾病者或其他系統(tǒng)惡性腫瘤者。共111例，男61例，女50例，年齡(57.21±9.06)歲，組織學(xué)分類：鱗癌57例，腺癌54例；分化程度：低分化35例，中-高分化76例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期66例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。

二、主要試劑和儀器

Trizol總RNA提取液購自武漢純度生物科技公司，One step RT-PCR kit購自北京索萊寶公司，miR-372和內(nèi)參引物由杭州浩克生物公司涉及合成，A549細(xì)胞購自上海通派生物公司，DMEM培養(yǎng)液、胰酶和胎牛血清購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，miR-372模擬序列及對照序列由上海美軒生物公司設(shè)計(jì)合成，CCK-8試劑盒購自武漢菲恩生物公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自上海銳賽生物公司，Transwell小室購自美國Costar公司，基質(zhì)膠和流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

三、qRT-PCR術(shù)檢測NSCLC和癌旁組織中miR-372表達(dá)

取組織，剪碎、充分研磨，使用Trizol總RNA提取液分離組織中總RNA，并檢測其濃度和純度。使用One step RT-PCR kit完成對總RNA逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過程，引物序列(見表1)。反應(yīng)條件：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s，74℃ 50s，循環(huán)30次。2-△△Ct法計(jì)算組織中miR-372表達(dá)量。

表1 引物序列

四、細(xì)胞培養(yǎng)和處理

用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)對A549細(xì)胞培養(yǎng)，條件：5% CO2、37℃。將對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后接種在6孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)至融合度在85%以上時，用Lipofectamine 2000行分組轉(zhuǎn)染：(1)M組：轉(zhuǎn)染miR-372模擬序列：5′-CCUCAAAUGUGGAGCACUAUUCU-3′；(2)NC組：轉(zhuǎn)染陰性對照：5′-GCUUGUGAUGGAGUAUUAUTT-3′；(3)N組：僅加入等量轉(zhuǎn)染試劑。處理后培養(yǎng)48h。

五、qRT-PCR術(shù)檢測細(xì)胞中miR-372表達(dá)

取處理后的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，其余步驟按1.3操作。

六、CCK-8實(shí)驗(yàn)

取處理后的細(xì)胞，消化后接種在96孔板，數(shù)量2×104/孔，恒溫箱中培養(yǎng)，分別在12、24、48、72和96h時，向各孔加入CCK-8液10μL，孵育2h，用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值(OD值)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

七、Annexin V-FITC/PI染色

取各組處理后48h細(xì)胞，離心取沉淀，用預(yù)冷PBS沖洗3次，取約2×105個細(xì)胞，用200μL的1×Binding Buffer重懸，加入5μL的Annexin V-FITC，搖勻，加入5μL的PI，避光反應(yīng)12min，用流式細(xì)胞儀檢測。

八、Transwell實(shí)驗(yàn)

用無血清培養(yǎng)液對基質(zhì)膠按1:6稀釋，平鋪在小室膜，放干。用胰酶將各組處理后細(xì)胞消化后，離心取細(xì)胞沉淀，加入無血清培養(yǎng)液制備2.5×104/mL的懸液，取200μL放到上室，取完全培養(yǎng)液600μL加到下室，培養(yǎng)24h，取出小室，棄培養(yǎng)液，去除上室散落細(xì)胞，固定，1%結(jié)晶紫染色15min，倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、NSCLC和癌旁組織中miR-372表達(dá)量比較

NSCLC和癌旁組織中miR-372表達(dá)量分別為(0.31±0.10)和(1.02±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=50.031，P<0.001)。

二、不同臨床指標(biāo)NSCLC組織中miR-372表達(dá)量比較

不同年齡、性別、吸煙史、腫瘤直徑、組織學(xué)分類的NSCLC組織中miR-372表達(dá)量無差異(P>0.05)，低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中miR-372表達(dá)量明顯低于中-高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

表2 miR-372在不同臨床指標(biāo)NSCLC組織中表達(dá)量比較

三、細(xì)胞中miR-372表達(dá)

M組、NC組和N組細(xì)胞中miR-372表達(dá)量分別為2.69±0.18、1.02±0.12和1.03±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=292.777，P<0.001)；M組細(xì)胞中miR-372表達(dá)量高于NC組和N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

四、細(xì)胞增殖能力

M組24、48、72和96h時細(xì)胞OD值低于NC組和N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力(OD值，

五、細(xì)胞凋亡情況

M組、NC組和N組細(xì)胞凋亡率分別為(32.27±3.58)%、(17.83±4.69)%和(16.09±3.01)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.347，P<0.001)，M組細(xì)胞凋亡率高于NC組和N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況(A：M組，B：NC組，C：N組)

六、細(xì)胞侵襲能力

M組、NC組和N組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(89.17±6.40)個、(131.17±10.48)個和(134.83±9.04)個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.758，P<0.001)；M組侵襲細(xì)胞數(shù)低于NC組和N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力(A：M組，B：NC組，C：N組，結(jié)晶紫×200)

討 論

目前，隨著手術(shù)及術(shù)后輔助治療手段的不斷進(jìn)步，顯著提高改善了NSCLC患者預(yù)后，延長了患者生存時間[10]，但高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移特性仍是影響治療效果的重要因素，嚴(yán)重影響了患者治療后生存率[11]。因此，從分子生物學(xué)角度明確與NSCLC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制，尋找敏感基因，對提高患者診療效果意義深遠(yuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)[12]，miRNA差異性表達(dá)與肺癌發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。而且參與調(diào)控了肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移網(wǎng)絡(luò)[13]。有研究指出[14]，miR-372參與調(diào)節(jié)了膀胱癌的轉(zhuǎn)移。Xu等[15]指出，MiR-372-3p通過靶向FXYD6抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。亦有研究指出[16]，MicroRNA-372通過激活PBK依賴性p53信號通路，增強(qiáng)放射敏感性同時抑制鼻咽癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，miR-372在NSCLC組織中呈低表達(dá)，可能在NSCLC發(fā)病中起抑癌基因的作用。本研究結(jié)果顯示，miR-372在低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中表達(dá)顯著降低，說明miR-372低表達(dá)可能參與了NSCLC惡性化病程進(jìn)展。

為進(jìn)一步明確miR-372在NSCLC進(jìn)程中的作用，采用轉(zhuǎn)染模擬物的方式提高A549細(xì)胞中miR-372表達(dá)，結(jié)果顯示，M組細(xì)胞中miR-372表達(dá)量高于NC組和N組，說明轉(zhuǎn)染模擬物后，A549細(xì)胞中miR-372表達(dá)量顯著升高。本研究結(jié)果顯示，M組24、48、72和96h時細(xì)胞OD值低于NC組和N組，說明升高A549細(xì)胞中miR-372表達(dá)量可明顯抑制細(xì)胞增殖活力。本研究結(jié)果顯示，M組細(xì)胞凋亡率低于NC組和N組，說明升高A549細(xì)胞中miR-372表達(dá)量可加速細(xì)胞凋亡。由此推測，升高miR-372表達(dá)可能通過降低細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡而在抑制肺癌進(jìn)程中發(fā)揮作用。Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，升高miR-372表達(dá)可明顯降低A549細(xì)胞侵襲能力。

綜上所述，miR-372在NSCLC組織中呈低表達(dá)，可能在NSCLC惡性化進(jìn)程中發(fā)揮抑癌基因的作用，升高A549細(xì)胞中miR-372表達(dá)，可抑制細(xì)胞增殖并加速細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞侵襲力，但其具體發(fā)揮作用的分子機(jī)制及可能涉及的信號通路有待開展進(jìn)一步的研究予以明確。