蘇世紅 尹永杰 張玉 徐愛暉

惡性胸腔積液(MPE)是腫瘤細(xì)胞播散至胸膜導(dǎo)致淋巴回流受阻引起的。MPE是中晚期肺癌最常見合并癥[1]，中位生存期僅4～12個(gè)月[2]。胸水脫落細(xì)胞學(xué)或胸膜活檢是診斷MPE主要方法[3]，但陽(yáng)性率較低。因此，腫瘤標(biāo)志物診斷MPE的功效受到了更多關(guān)注。

臨床常用的肺癌三項(xiàng)包括癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白可溶性片段211(CYFRA211)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，因不穩(wěn)定性及多樣表達(dá)對(duì)MPE診斷存在局限性[4-5]。異常糖鏈糖蛋白(TAP)是細(xì)胞癌變后基因表達(dá)的特異性物質(zhì)。熱休克蛋白90α(Hsp90ɑ)為可提示腫瘤增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)[6]。目前，關(guān)于TAP和Hsp90ɑ對(duì)MPE診斷評(píng)估的研究甚少。本研究通過(guò)TAP和Hsp90ɑ在外周血和胸腔積液中差異表達(dá)，評(píng)價(jià)其在肺癌惡性胸腔積液診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)中的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究為前瞻性研究，該研究經(jīng)我院論理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：PJ2022-06-35)，所有患者均被告知研究目的及程序，簽署書面知情同意書。收治2019年2月-2020年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科67例胸腔積液和肺部占位患者，隨訪1年至2021年12月，期間中途退出6例，失訪7例，最終入組54例患者。男性39例(72.22%)，女性15例(27.78%)，年齡23～91歲。分為良性胸腔積液組19例，肺癌惡性胸腔積液組18例,Ⅲ期～Ⅳ期肺癌(不伴有胸腔積液)組即中晚期肺癌組17例，在性別、年齡構(gòu)成比上，各組研究對(duì)象差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)分組：肺癌惡性胸腔積液組和中晚期肺癌組：依據(jù)《惡性胸腔積液診斷與治療專家共識(shí)》[7]、《中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)肺癌臨床診療指南(2021版)》[8]和《國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)(第八版)》[9]，經(jīng)胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)、經(jīng)皮肺穿刺活檢和支氣管鏡證實(shí)查見癌細(xì)胞；進(jìn)行頭顱MRI、骨ECT或PET-CT等檢查綜合評(píng)估；良性胸腔積液組：依據(jù)臨床表現(xiàn)、上述病理檢查及治療后效果等綜合為良性胸腔積液(結(jié)核性胸膜炎、肺部感染、低蛋白血癥等)；(2)入院前未接受針對(duì)性治療；(3)精神狀態(tài)良好，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他臟器惡性腫瘤；(2)存在手術(shù)禁忌或麻醉藥物過(guò)敏者；(3)依從性差，中途退出或失訪者。

二、試劑與儀器

CEA、CYFRA21-1和NSE檢測(cè)由瑞士羅氏公司的酶聯(lián)免疫(ELISA法)試劑盒和電化學(xué)發(fā)光分析儀完成。TAP檢測(cè)由瑞生醫(yī)療科技有限公司TAP(凝聚法)試劑盒和瑞生TAP醫(yī)學(xué)顯微圖像分析儀完成。Hsp90ɑ檢測(cè)由普羅吉生物科技發(fā)展有限公司Hsp90ɑ試劑盒和DIATEK DR-200B系列酶標(biāo)儀分析儀完成。

三、研究方法

1 標(biāo)本的收集及處理

(1)外周血：清晨、空腹，采集靜脈血(EDTA抗凝管)2mL，4 ℃, 1500 r/min, 離心15 min，分離血漿用于Hsp90ɑ檢測(cè)；另采集3～5mL無(wú)添加劑的非抗凝血標(biāo)本，分離血清，用于TAP、CEA、CYFRA21-1和NSE檢測(cè)。

(2)胸腔積液：常規(guī)消毒行胸腔穿刺抽液術(shù)，抽取100mL胸腔積液，3000r/min，離心5min，棄上清，加入適量細(xì)胞清洗液，重復(fù)上述操作，取上清液和紅細(xì)胞中間的細(xì)胞層作涂片，固定、HE染色后顯微鏡下觀察；考慮為可疑腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步做石蠟包埋切片，行免疫組化。

(3)腫瘤組織：電子支氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺活檢、超聲支氣管鏡(EBUS)刷檢細(xì)胞學(xué)涂片，HE染色后觀察細(xì)胞形態(tài)，考慮為可疑癌細(xì)胞或癌細(xì)胞，行免疫組化。

2 測(cè)定方法

(1)肺癌三項(xiàng)：用電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法，按羅氏試劑盒操作，電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)含量。

(2)Hsp90ɑ：用ELISA法按PROTGEN試劑盒步驟檢測(cè)，酶免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

(3)TAP：取30μl全血，滴2滴血液涂血片，靜置晾干，間隔均勻滴加凝聚助劑，自然干燥2小時(shí)后將其放置顯微鏡下，找TAP凝聚顆粒測(cè)定面積。TAP凝聚顆粒呈淡黃色、棕黃色或淡綠色，周圍呈棕墨綠色或黑色，呈不規(guī)則類圓形。單顆凝聚顆粒面積>81 μm2的特異凝集物為有效凝集顆粒。若單顆顆凝聚顆粒面積≥225μm2，則結(jié)果為“該顆粒面積”；如果有效凝聚顆?！?，為所有顆粒實(shí)測(cè)面積之和×0.62為特異凝集物的最終數(shù)值。

四、判讀標(biāo)準(zhǔn)

CEA正常參考值<5.0 ng/mL。NSE正常參考值<3.3ng/mL。CYFRA21-1正常參考值<16.3ng/mL。Hsp90ɑ正常參考值范圍0～82ng/mL。TAP正常參考值：陰性：無(wú)明顯凝聚物(面積0～121μm2)；陽(yáng)性：凝聚物較小(面積121～225μm2)/較大(面積≥225μm2)。

五、隨訪

電話或門診隨訪，隨訪時(shí)間截止于2021年12月31日，期間退出6例(0.09%)，失訪7例(0.1%)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、外周血中肺癌三項(xiàng)、TAP和Hsp90a的表達(dá)水平。

與良性胸腔積液組比較，肺癌惡性胸腔積液組和中晚期肺癌組外周血中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90a的表達(dá)水平顯著升高，且肺癌惡性胸腔積液組升高更明顯(見表1)。

表1 三組患者外周血中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90ɑ的表達(dá)

二、外周血中肺癌三項(xiàng)、TAP和Hsp90a在肺癌惡性胸腔積液患者中的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90a均具有診斷價(jià)值(P<0.05)(圖1A)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)診斷價(jià)值更高，不僅高于單項(xiàng)指標(biāo)的診斷價(jià)值，且TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)AUC值(AUC=0.915)高于肺癌三項(xiàng)的AUC值(AUC=0.904)(P<0.05)(圖1B)。

圖1 A ROC曲線示外周血中肺癌三項(xiàng)、TAP和Hsp90a在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價(jià)值.B ROC曲線示外周血中TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)與肺癌三項(xiàng)在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價(jià)值。

三、外周血中肺癌三項(xiàng)、TAP和Hsp90a在中晚期肺癌患者中的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90a對(duì)中晚期肺癌患者均具有診斷價(jià)值(P<0.05)(圖2A)；聯(lián)合檢測(cè)較單項(xiàng)檢測(cè)診斷價(jià)值更高，TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)AUC值(AUC=0.892)高于肺癌三項(xiàng)的AUC值(AUC=0.879)，TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于中晚期肺癌患者的診斷價(jià)值高于肺癌三項(xiàng)(P<0.05)(圖2B)。

圖2 A ROC曲線示外周血中肺癌三項(xiàng)、TAP和Hsp90a在中晚期肺癌中的診斷價(jià)值。B ROC曲線示外周血中TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)與肺癌三項(xiàng)在中晚期肺癌中的診斷價(jià)值。

四、胸腔積液中肺癌三項(xiàng)、TAP和Hsp90a在肺癌惡性胸腔積液患者中的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，胸腔積液中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90a對(duì)肺癌惡性胸腔積液患者均具有診斷價(jià)值(P<0.05)(表2、圖3A)；胸腔積液中TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)AUC值(AUC=0.974)高于肺癌三項(xiàng)的AUC值(AUC=0.921)，胸腔積液中TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于肺癌惡性胸腔積液患者的診斷價(jià)值比肺癌三項(xiàng)更有意義(P<0.05)(圖3B)。

圖3 A ROC曲線示胸腔積液中肺癌三項(xiàng)、TAP和Hsp90a在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價(jià)值。B ROC曲線示胸腔積液中TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)與肺癌三項(xiàng)在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價(jià)值。

表2 兩組患者胸腔積液中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90ɑ的比較

五、肺癌惡性胸積液患者生存期分析

單因素COX回歸分析結(jié)果顯示(表3)，胸腔積液中的TAP和Hsp90ɑ與肺癌惡性胸腔積液患者生存期相關(guān)(P<0.05)，將其分析結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析(表4)，結(jié)果顯示胸腔積液中TAP和Hsp90ɑ均為獨(dú)立影響因素和危險(xiǎn)因素(P<0.05)，TAP和Hsp90ɑ表達(dá)量越高，生存期越短(圖4A、圖4B)。

表3 單因素COX回歸分析

表4 多因素COX回歸分析

圖4 A TAP作為獨(dú)立影響因素的生存曲線圖。B Hsp90a作為獨(dú)立影響因素的生存曲線圖。

討 論

我國(guó)每年約有100萬(wàn)MPE患者，肺癌占MPE病因的1/3[10]。因MPE診斷陽(yáng)性率差異大，陽(yáng)性率偏低，受腫瘤負(fù)荷、病理診斷醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)、腫瘤類型等多種因素影響[11]，導(dǎo)致近40%MPE患者無(wú)法明確診斷。在過(guò)去的幾十年中，肺癌惡性胸腔積液的5年生存率無(wú)顯著提升。因此，尋找直接或間接反應(yīng)惡性病變的腫瘤標(biāo)志物，探討其診斷價(jià)值及評(píng)估預(yù)后，是現(xiàn)今臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

腫瘤標(biāo)志物在組織里的濃度較高，需要達(dá)到一定濃度才可以檢測(cè)出，因此對(duì)檢測(cè)技術(shù)的要求、組織取材量以及患者配合度，都有一定的要求，對(duì)診斷造成了一定的局限性，因此臨床上多同時(shí)采用易獲取的外周血用于協(xié)助診斷。TAP位于腫瘤細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中，糖鏈的分子小，易于定量測(cè)量，在疾病狀態(tài)下改變較為顯著，可間接反應(yīng)細(xì)胞癌變的發(fā)生和發(fā)展情況。TAP可將幾十種異常糖鏈糖蛋白高度聚集，極大地放大了腫瘤信號(hào)，從而在一定程度上提升了腫瘤檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，有效地減少漏診率。有研究證實(shí)，癌細(xì)胞表面異?；腔?、糖鏈的差異表達(dá)與其侵襲、發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)[12]。Hsp90α是存在真核細(xì)胞中的分子伴侶蛋白，參與細(xì)胞活化、凋亡、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。有報(bào)道稱，肺癌患者癌組織中Hsp90α表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，惡性胸腔積液中Hsp90α表達(dá)明顯升高，提示Hsp90α可能與肺癌惡性胸腔積液有關(guān)[13]。這與我們的研究結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)肺癌惡性胸腔積液組患者，無(wú)論是外周血還是胸腔積液中TAP和Hsp90α的表達(dá)水平，較良性胸腔積液組和中晚期肺癌組均明顯升高，中晚期肺癌組外周血中TAP和Hsp90α表達(dá)，較良性胸腔積液組表達(dá)增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見，TAP和Hsp90α對(duì)肺癌惡性胸腔積液具有潛在的診斷效能。

目前腫瘤標(biāo)志物種類較多，由于單一指標(biāo)檢測(cè)對(duì)惡性腫瘤診斷的靈敏度與特異度均不高，故多采用聯(lián)合檢測(cè)。目前臨床上廣泛使用的肺癌三項(xiàng)可有效判斷肺癌，但在肺癌惡性胸腔積液的診斷中，既往的研究結(jié)果提示其靈敏度和特異度相對(duì)較低。TAP和Hsp90α在肺癌惡性胸腔積液的研究甚少，二者聯(lián)合檢測(cè)目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究中ROC曲線分析結(jié)果顯示肺癌惡性胸腔積液組患者外周血和胸腔積液中TAP和Hsp90α聯(lián)合檢測(cè)的AUC值不僅高于良性胸腔積液組和中晚期肺癌組AUC值，還明顯高于各組中肺癌三項(xiàng)的AUC值，提示TAP和Hsp90a聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于肺癌惡性胸腔積液的診斷效能更優(yōu)。進(jìn)一步分析我們發(fā)現(xiàn)，肺癌惡性胸腔積液患者在胸腔積液中聯(lián)合檢測(cè)TAP和Hsp90α的AUC值高于外周血中的AUC值，說(shuō)明胸腔積液中TAP和Hsp90α的聯(lián)合檢測(cè)在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價(jià)值比外周血中聯(lián)合檢測(cè)更有意義；若胸腔積液和外周血同時(shí)檢測(cè)，可能更有助于肺癌惡性胸腔積液的診斷。肺癌惡性胸腔積液患者胸腔積液中TAP和Hsp90α表達(dá)水平明顯高于外周血中的表達(dá)，考慮與肺癌胸膜轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的惡性胸腔積液中腫瘤標(biāo)志物的濃度增加有關(guān)，也意味著病情進(jìn)展到終末期，預(yù)后可能也較差。為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們進(jìn)行了維持1年的隨訪，經(jīng)COX回歸分析結(jié)果顯示，胸腔積液中TAP、Hsp90a的表達(dá)水平與肺癌惡性胸腔積液患者預(yù)后密切相關(guān)，是影響生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。依據(jù)研究的預(yù)測(cè)模型，TAP和Hsp90a可指導(dǎo)疑似肺癌惡性胸腔積液患者進(jìn)一步行病理檢測(cè)確診；并且聯(lián)合患者臨床相關(guān)資料、TAP和Hsp90a檢測(cè)結(jié)果等可有效預(yù)測(cè)患者預(yù)后。

綜上所述，TAP和Hsp90α在肺癌惡性胸腔積液患者胸腔積液和外周血中表達(dá)量均較高，二者聯(lián)合檢測(cè)可提升其診斷的特異度和靈敏度，對(duì)肺癌惡性胸腔積液的篩查、診斷及其預(yù)后，可能具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。TAP和Hsp90α聯(lián)合檢測(cè)能否用于肺癌惡性胸腔積液風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模式，仍需要更多的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。