劉 健 孫 潔 曹慧丹

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

支氣管哮喘（哮喘）是常見的慢性呼吸道疾病，氣道重塑被認(rèn)為是引起哮喘氣道高反應(yīng)性和不可逆性氣道阻塞的病理基礎(chǔ)，是哮喘難治的根本原因［1-2］。抑制氣道重塑這一病理過程，對(duì)于改善哮喘患者肺功能、提高生活質(zhì)量具有很重要的意義。全球哮喘防治倡議組織（GINA）推薦哮喘的一線治療方案包括吸入糖皮質(zhì)激素及支氣管擴(kuò)張劑等，雖有部分?jǐn)?shù)據(jù)顯示，其可能通過干預(yù)氣道慢性炎癥間接改善或延緩氣道重塑，但并無證據(jù)表明其直接療效，其作用有限且長時(shí)間使用糖皮質(zhì)激素也存在一系列不良反應(yīng)［3］。因此，亟待研究新的氣道重塑干預(yù)藥物和手段。

中藥復(fù)方補(bǔ)肺顆粒針對(duì)哮喘長期反復(fù)發(fā)作出現(xiàn)“氣虛血瘀”的病理變化，能起到補(bǔ)益肺腎之氣、活血通絡(luò)祛瘀之用。前期臨床研究表明，補(bǔ)肺顆粒能夠有效改善哮喘緩解期患者的氣道阻塞并改善小氣道通氣功能，提高哮喘患者的控制水平，減少哮喘癥狀急性發(fā)作［4-5］。本研究旨在觀察補(bǔ)肺顆粒對(duì)哮喘氣道平滑肌細(xì)胞及氣道血管生成的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔BALB/C雌性SPF級(jí)小鼠30只，6～8周，體質(zhì)量18～22 g。所有小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，溫度20～26℃，濕度40%～70%，通風(fēng)次數(shù)為15次/h全新風(fēng)，光照為12 h明、12 h暗。

1.2 試劑與藥物 1）藥物：補(bǔ)肺顆粒由天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑室提供。主要成分為黨參20 g，熟地黃20 g，山茱萸肉20 g，赤芍20 g，當(dāng)歸20 g，炙麻黃6 g，陳皮20 g，紫菀10 g，黃芩 10 g，桑白皮20 g，甘草6 g。將其制成1 g/mL的水溶液備用。2）試劑：OVA Al（OH）3混合液：以10 mg卵蛋白干粉（Sigma，批號(hào)：SLCG1876）溶于5 mL生理鹽水中，搖勻。取其中1 mL加入4 mL 0.9%氯化鈉注射液，再加入等體積（5 mL）氫 氧 化 鋁（Thermo Fisher Scientific，批 號(hào) ：VC298268）搖勻。每次使用前需新鮮配制。兔抗VEGF單克隆抗體（abcam，批號(hào)：Ab52917），兔抗內(nèi)皮抑素單克隆抗體（abcam，批號(hào)：Ab207162），兔抗羊IgG二抗（中杉金橋生物技術(shù)，批號(hào)：ZB-2301），Anti-GAPDH（bioworld，批號(hào)：AP0063）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 純水儀（寧波丹斯博頓環(huán)保科技責(zé)任有限公司，CM-RO-C2）；紫外分光光度計(jì)（上海讓奇儀器科技有限公司，D8PCS）；研磨器（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，MY-10）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，DYY-6C）；電泳槽（北京六一生物科技有限公司，DYCZ-40D）；轉(zhuǎn)膜槽（北京六一生物科技有限公司，DYCZ-40G）；凝膠玻璃板、固定夾（北京六一生物科技有限公司）；萬分位天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司，PR SERIES）；全自動(dòng)化學(xué)/熒光/凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，Champchemi 610 plus）；制冰機(jī)（常熟市雪科電器有限公司，IMS-50）；低溫高速離心機(jī)（北京新時(shí)代北利醫(yī)療儀器設(shè)備有限公司，GTR16-2）；搖床（泰州諾米醫(yī)療，NMYA-60）；-80℃醫(yī)用冰箱（海爾，DW-86L338J）；鼓風(fēng)式干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司，101-3）；實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；PCR儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，Hema9700）。

1.4 含藥血清制備 BALB/C小鼠18只隨機(jī)分為對(duì)照組、高劑量組和低劑量組，每組小鼠各6只，實(shí)驗(yàn)前先禁食12 h。參照文獻(xiàn)［6］中動(dòng)物體表面積比率換算等效劑量，低劑量組、高劑量組分別按照1.42 g/（kg·d）、2.84 g/（kg·d）劑量給予中藥灌胃，每日2次，連續(xù)給藥3 d。對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。在末次給藥后，于無菌條件下自心臟處采血，離心血清（3 000 r/min，4℃，20 min），血清經(jīng)56℃、30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，于-20℃條件下冷凍備用。

1.5 模型制備 BALB/C小鼠12只，參照文獻(xiàn)［7］，以O(shè)VA Al（OH）3混合液腹腔注射致敏及霧化吸入OVA激發(fā)的方法制作哮喘小鼠模型，具體制作模型方法如下：小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，于造模第1日、第14日腹腔注射0.1 mL OVA Al（OH）3混合液，自第21日起予以0.1%OVA溶液霧化吸入，隔日1次，每次30 min，共霧化18次。

1.6 支氣管平滑肌細(xì)胞（ASMC）分離培養(yǎng)、分組及干預(yù) 小鼠造模成功后處死，分離肺組織并剝脫肌層、剪碎，用0.25%胰蛋白酶，38.5℃水浴消化2 h左右。1 000 r/min離心5 min后，棄上清。加入培養(yǎng)基，在20%O2、5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天換液1次，待14 d左右時(shí)觀察90%細(xì)胞融合后，傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)選用2～5代細(xì)胞。接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，中藥組分別給予中藥低、高劑量含藥血清，對(duì)照組予正常血清。同時(shí)換用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 觀察指標(biāo) 1）測(cè)定ASMC增殖率：在96孔板中接種細(xì)胞懸液每孔100 μL，細(xì)胞的接種數(shù)量約為每孔5 000個(gè)細(xì)胞。每孔加入10 μL的CCK8溶液，以加相應(yīng)量的細(xì)胞培養(yǎng)基和CCK8不加細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值。Graphpad5.0計(jì)算抑制率。抑制率（%）=（1-OD給藥組/OD對(duì)照組）×100%。2）Western blotting測(cè)定ASMC血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、內(nèi)皮抑素（ES）相對(duì)表達(dá)：提取總蛋白，用BCA法蛋白定量。隨后進(jìn)行蛋白凝膠電泳，當(dāng)電泳完成后，通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上。5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加兔抗VEGF單克隆抗體（1∶10 000稀釋）及兔抗內(nèi)皮抑素單克隆抗體（1∶5 000稀釋）孵育過夜。加入酶標(biāo)記的兔抗羊IgG（1∶5 000稀釋）二抗孵育2 h。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參。用Image J軟件分析灰度值。3）RT-PCR檢測(cè)ASMC VEGF mRNA及ES mRNA相對(duì)表達(dá)：制備組織細(xì)胞總RNA，計(jì)算RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)物于-20℃保存。利用PubMed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物（表 1）。RT-PCR反應(yīng)體系：體積為 25 μL；Oligo（dT）18（50 pmol/μL）1 μL，RNA模板1 μg，DEPC水加水補(bǔ)齊至13.4 μL，70 ℃ 5 min，冰凍10 min，MLV（RT）1 μL，5×Buffer 5 μL，Dntp 5 μL，Recombinant Rnase Inhibitor 0.6 μL，42℃，60 min。反應(yīng)程序：50℃預(yù)變性2 min，95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，56～58℃退火加延伸1 min，45個(gè)循環(huán)。

表1 RT-PCR引物系列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較行單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠ASMC增殖情況比較 見表2。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，中藥高劑量組和低劑量組的OD值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組小鼠ASMC增殖情況比較（%，±s）

表2 各組小鼠ASMC增殖情況比較（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；-為無數(shù)據(jù)。下同。

組別對(duì)照組中藥低劑量組中藥高劑量組n 6 6 6 OD值1.01±0.35 0.92±0.21**0.88±0.22**抑制率-10.53±2.61 15.56±2.84

2.2 各組小鼠ASMC VEGF及ES相對(duì)表達(dá)量的比較 見表3，圖1。分析結(jié)果顯示，中藥低劑量組和高劑量組的VEGF及內(nèi)皮抑素的相對(duì)表達(dá)顯著降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠ASMC VEGF及ES相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表3 各組小鼠ASMC VEGF及ES相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

組別對(duì)照組中藥低劑量組中藥高劑量組n 6 6 6 VEGF 1.00±0.00 0.71±0.07**0.50±0.13**ES 1.00±0.00 0.87±0.11*0.69±0.12**

圖1 各組ASMC VEGF及ES表達(dá)

2.3 各組小鼠VEGF mRNA及ES mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 見表4。分析結(jié)果顯示，中藥高劑量組的VEGF mRNA及ES mRNA的相對(duì)表達(dá)顯著降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。低劑量組ASMC VEGF及ES相對(duì)表達(dá)有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組小鼠VEGFmRNA及ESmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表4 各組小鼠VEGFmRNA及ESmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

組別對(duì)照組中藥低劑量組中藥高劑量組n 6 6 6 VEGF 1.01±0.14 0.99±0.12 0.36±0.51**ES 1.01±0.11 0.93±0.96 0.86±0.14**

3 討 論

哮喘患者ASM質(zhì)量的增加是與哮喘嚴(yán)重程度、肺功能下降和氣道收縮增強(qiáng)相關(guān)的氣道重塑關(guān)鍵特征。目前，除了支氣管擴(kuò)張劑外，尚無其他臨床批準(zhǔn)的有效藥物專門針對(duì)ASM收縮和增生。炎癥細(xì)胞分泌的多種生長因子和細(xì)胞因子參與了ASMC的生長和分裂，其中VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞生長、血管生成和增加血管通透性的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，在促進(jìn)血管生成、重塑中發(fā)揮重要作用［8-9］。因此抑制VEGF的分泌能夠降低基底膜厚度、減少杯狀細(xì)胞增生［10］。最近研究發(fā)現(xiàn)，由ASMC分泌的VEGF在纖維連接蛋白分泌、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)、平滑肌肥大和重構(gòu)中發(fā)揮重要作用［11］。因此，Sung-Ho Kim等通過抑制VEGF誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)了對(duì)ASMC增殖的抑制作用［12］。ES作為內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成的專一性抑制因子，具有強(qiáng)大的抑制血管生成的作用，這為抗血管生成治療提供了理論依據(jù)。Asai等［13］研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者誘導(dǎo)痰中VEGF與ES水平存在相關(guān)性，且二者的不平衡會(huì)導(dǎo)致血管生成，從而對(duì)哮喘發(fā)病有重要影響。Kim等［14］發(fā)現(xiàn)ES等阻斷VEGF與受體結(jié)合及其下游分子磷酸化過程，最終抑制VEGF的促血管生成作用，且內(nèi)皮抑素對(duì)VEGF促血管生成作用的抑制率能達(dá)到50%。因此，調(diào)節(jié)VEGF及ES水平對(duì)于調(diào)節(jié)哮喘氣道血管生成有重要意義。這些為我們的治療提供了思路。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為“久病入瘀”，由于哮喘的反復(fù)發(fā)作，肺氣不能布津行血而致血行不暢，瘀血內(nèi)生，且痰濁阻滯，氣血不暢，亦可生瘀。痰凝血瘀伏藏于肺，影響肺臟正常的宣發(fā)肅降功能，導(dǎo)致哮喘發(fā)作。因此“氣虛血瘀”是哮喘反復(fù)發(fā)作的主要病理變化。這種痰瘀氣阻的病理特征使病情遷延，纏綿難愈，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于哮喘氣道重塑細(xì)胞外基質(zhì)沉積，支氣管平滑肌增生，血管通透性增加，炎性分泌物增多，氣道壁血管增生重塑，結(jié)果導(dǎo)致氣道狹窄，缺血缺氧，嚴(yán)重影響氣道通氣功能的認(rèn)識(shí)有相通之處［15］，這些都符合哮病“氣虛血瘀”的基本病機(jī)。因此哮病“氣虛血瘀”病機(jī)與哮喘氣道重塑及血管生成必然的相關(guān)性。針對(duì)這一病理變化孫增濤教授制定了“補(bǔ)氣活血”的基本法則，以補(bǔ)肺顆粒干預(yù)哮喘旨在起到補(bǔ)益肺腎之氣、活血通絡(luò)祛瘀之用。前期臨床研究表明，補(bǔ)肺顆粒能夠有效改善哮喘緩解期患者的氣道阻塞并改善小氣道通氣功能，提高哮喘患者的控制水平，減少哮喘癥狀急性發(fā)作［4-5］。

本次實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)肺顆粒含藥血清能有效抑制哮喘氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，且隨著藥物劑量增加其抑制作用隨之增強(qiáng)。補(bǔ)肺顆粒含藥血清可顯著降低氣道平滑肌細(xì)胞VEGF及ES的相對(duì)表達(dá)，且隨著藥物劑量增加其降低作用更明顯。尤其是高劑量含藥血清能夠降低氣道平滑肌細(xì)胞VEGF mRNA及ES mRNA的相對(duì)表達(dá)，這一點(diǎn)與低劑量組有差異，提示藥物劑量與效果之間有一定關(guān)聯(lián)，臨床中需要足量給藥能夠更好地發(fā)揮作用。

綜上所述，補(bǔ)肺顆粒含藥血清能通過有效抑制哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善哮喘氣道重塑狀態(tài)。其作用機(jī)制可能與抑制VEGF及內(nèi)皮抑素表達(dá)，調(diào)節(jié)氣道血管生成有關(guān)。