王文霞，劉 博，陳瑞國，王慧敏，王中雙

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/黑龍江省果蔬雜糧飲品工程技術(shù)研究中心/黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

果膠是一種廣泛分布于高等植物細(xì)胞壁中的復(fù)雜酸性多糖，主要由D-半乳糖醛酸（Galacturonic acid，GalA）和鼠李糖（Rhamnose，Rha）、阿拉伯糖（Arabinose，Ara）、半乳糖（Galactose，Gal）、D 木糖（Xylose，Xyl）等單糖組成[1]。果膠分子的主鏈由D-半乳糖醛酸單元通過（1-4）糖苷鍵連接而成，側(cè)鏈上有半乳聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖等中性糖[2]。此外，GalA殘基在C-6位點部分發(fā)生甲基酯化，在O-2 和O-2 位點發(fā)生乙酰酯化O-3[3]。果膠通常由線性同型半乳糖醛酸聚糖（HG）、高度支化的鼠李半乳糖醛酸聚糖I（RG-I）、鼠李半乳糖醛酸聚糖II（RG-II）結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[4]。商品柑橘和蘋果果膠主要由HG結(jié)構(gòu)域組成，通常采用高溫強酸方法提取，RG-I 含量較低，GalA 一般高于65%，常被用作食品加工中的膠凝劑和增稠劑。RG-I 型果膠是指主要以RG-I 結(jié)構(gòu)域組成的果膠，馬鈴薯、黃秋葵、胡蘿卜等含有的果膠主要是RG-I 型果膠[5]。傳統(tǒng)的高溫強酸提取條件會破壞RG-I 結(jié)構(gòu)域，而采用溫和的提取方法可保留較多RG-I 結(jié)構(gòu)域[6]。富含RG-I結(jié)構(gòu)的果膠因其富含半乳聚糖側(cè)鏈和乙酰基鏈結(jié)構(gòu)特性，使其具有腸道益生性、抗癌等功能活性[7]，成為潛在的生物活性分子來源；同時，不同來源的RG-I 型果膠的膠凝特性[8,9]和乳化性及穩(wěn)定性[10]研究也備受關(guān)注，并研究其定向提取和功能性膠體的開發(fā)。果膠的組成和精細(xì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)取決于果膠的來源、提取方法及條件等因素[11]。酸法、酶法和堿法是最常見的果膠提取方法。目前，國內(nèi)主要采用酸法提取制備商品蘋果、柑橘類果膠，其會導(dǎo)致大部分RG-I 結(jié)構(gòu)域的主鏈半乳糖醛酸-鼠李糖鍵的斷裂和中性糖側(cè)鏈的降解[12]，以提高商品果膠的凝膠特性。酶法可制備富含RG-I 結(jié)構(gòu)域的果膠多糖，且可減少廢酸或廢堿溶液的排放，但比酸法耗時長[13,14]。堿法提取常被用于制備RG-I 型果膠。在堿性條件下，果膠多糖的HG結(jié)構(gòu)會通過β-消除作用而水解，而果膠中的中性糖側(cè)鏈被保留，從而使RG-I結(jié)構(gòu)域占比更高。

馬鈴薯渣是馬鈴薯淀粉加工業(yè)的副產(chǎn)物，目前其主要作為動物飼料成分。馬鈴薯渣富含非淀粉多糖，其中果膠是細(xì)胞壁的主要多糖[15]。由于馬鈴薯渣具有較高的果膠含量，因此是一種潛在的豐富果膠新資源。馬鈴薯果膠具有RG-I 結(jié)構(gòu)域高占比和HG 結(jié)構(gòu)域低占比的獨特結(jié)構(gòu)特征[2]。近年來，先后開展了采用高溫堿性法（0.5～2.0 mol∕L NaOH，60～80℃，3～24 h）提取馬鈴薯RG-I 型果膠及其性質(zhì)的研究[13,16,17]。但是，有關(guān)較溫和的低溫短時稀堿法提取馬鈴薯果膠結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的研究還未見報道。

本研究以馬鈴薯渣為原料，采用低溫短時稀堿法提取馬鈴薯果膠（Alkali extraction of potato pectin，APP），對所得果膠組成及乳化性質(zhì)進(jìn)行表征，以期為馬鈴薯渣果膠的開發(fā)及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

濕馬鈴薯渣（北大荒馬鈴薯產(chǎn)業(yè)有限公司），Suhong AA Plus 2X 耐高溫α-淀粉酶（95℃，酶活力40 000 U∕g）（丹麥諾維信公司），Alcalase 2.4 L FG水解蛋白酶（酶活力102 511 U∕g）（丹麥諾維信公司），其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），TDL-5-A 型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），30K 中空纖維膜（天津膜天膜有限公司），UF 型超濾裝置（河北省華泰凈化技術(shù)工程公司），PB-10 酸度計（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），PRIMAIDE高效液相色譜儀（日本日立公司），Alpha2-4 LSCbasic 型冷凍干燥機（德國CHRIST 公司），1H NMR Varian-Inova 600 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀（美國布魯克公司），TESCAN MIRA LMS 掃描電子顯微鏡[泰思肯（中國）有限公司]，PANDA plus2000超高壓均質(zhì)機（意大利Niro公司），BT-9300ST激光粒度分布儀（丹東百特儀器公司），Spectrum One傅里葉變換紅外光譜儀（美國PE公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 馬鈴薯果膠提取

工藝流程[18]：

濕馬鈴薯渣→晾曬風(fēng)干→粉碎（過80 目篩）→脫淀粉、蛋白質(zhì)→薯渣I→0.4%鹽酸預(yù)處理→薯渣Ⅱ→堿法提取果膠→過濾→調(diào)pH 2.8，靜置，離心→上清液→超濾純化→濃縮液→乙醇沉淀→過濾→冷凍干燥→成品。

操作要點[18]：

（1）脫淀粉、蛋白質(zhì)：稱取干燥過篩的200 g馬鈴薯渣加到8 L 水中（固液比為1∶40），攪拌均勻，用HCl溶液調(diào)節(jié)體系pH 6.0。加入5%（對干馬鈴薯渣）耐高溫α-淀粉酶，95℃，攪拌3 h。趁熱過濾，棄掉濾液，將濾渣用75℃熱水反復(fù)洗滌3 次。將所得濾渣再加入8 L 水，調(diào)節(jié)溶液pH 至8.0，加入5%（對馬鈴薯渣）的堿性蛋白酶，55℃酶解2 h。100℃水浴加熱10 min，滅酶；然后趁熱過濾。濾渣經(jīng)55℃熱水洗滌3次，晾曬風(fēng)干得薯渣I。

（2）0.4%鹽酸預(yù)處理：稱取200 g 薯渣I，按照料液比1∶30，加入0.4%（v∕v）鹽酸溶液，混合均勻，在室溫下攪拌60 min，用400目濾布過濾，得薯渣Ⅱ。

（3）堿法提取果膠：將薯渣Ⅱ按照料液比1∶30加入0.15 mol∕L NaOH 溶液，混合均勻，在32℃攪拌提取30 min。用400目濾布過濾得濾液，濾渣用1 L 純水洗滌2 次，洗滌液與濾液合并，得果膠提取液。

（4）調(diào)pH 2.8，離心：調(diào)節(jié)濾液pH 2.8，靜置2 h。4 000 r∕min，離心15 min，收集上清液。

（5）超濾：采用30 kDa 的中空纖維膜，在0.1 MPa、室溫下，對上清液進(jìn)行超濾純化處理。對濃縮液采用超純水洗滌，原液與濃縮液的濃縮比為5，最終超濾濃縮液的電導(dǎo)率小于500 μs∕cm。

（6）乙醇沉淀：濃縮液與乙醇體積比按1∶4 進(jìn)行乙醇沉淀果膠，靜置12 h，果膠析出，采用300目的濾布過濾，得到粗果膠。

（7）干燥：粗果膠采用冷凍干燥，得到堿法馬鈴薯果膠多糖（APP）。

（8）得率計算：根據(jù)所得果膠物料重量比薯渣I重量得到提取得率。

1.3.2 馬鈴薯果膠的理化性質(zhì)研究

（1）馬鈴薯果膠的灰分、水分及蛋白質(zhì)含量測定：采用灼燒法[19]測定果膠多糖中灰分含量。采用干燥法[20]測定水分含量。采用杜馬斯燃燒法[21]測定蛋白質(zhì)含量。

（2）果膠的甲酯化度和乙?；葯z測：采用核磁共振方法測定果膠甲酯化度（Degree of methylation，DM）和乙?；龋―egree of acetylation，DA）[17]。

（3）馬鈴薯果膠分子量的測定：采用尺寸排除色譜法測定果膠分子量[18]。色譜條件為：UltrahydrogelTMLinear，300 mm×7.8 mm水相凝膠柱，柱溫40℃，示差檢測器，檢測器溫度40℃。以T20、T50、T100、T200、T1000、T2000 作為標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為2 mg∕mL，進(jìn)樣量20 μL，洗脫液為0.02 mol∕L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），流速0.5 mL∕min。以保留時間tR為橫坐標(biāo)，LgMw為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。果膠樣品同標(biāo)準(zhǔn)品濃度配制，過0.45 μm濾膜。據(jù)圖譜中所得保留時間，通過上述回歸方程計算果膠多糖相對分子量。

（4）果膠中中性單糖和酸性單糖含量的測定：采用PMP 衍生化-高效液相色譜法[18]，測定果膠中中性單糖和酸性單糖的含量。

（5）傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測定：取少量APP樣品，采用KBr壓片，利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測試，測試波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1。

（6）掃描電子顯微鏡（SEM）分析：將APP 研磨成細(xì)粉，把制備好的樣品進(jìn)行噴金處理，然后將其置于場發(fā)射SEM中以觀察果膠微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.3 馬鈴薯果膠乳化特性分析

（1）乳狀液的制備：分別配置濃度0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%果膠溶液，將其與固定量玉米油混合，配置為10%油相體積分?jǐn)?shù)的混合液，在高速剪切機上以16 000 r∕min 的速度剪切3 min，制成初乳液，隨后將初乳液在高壓均質(zhì)機上以50 Mpa的均質(zhì)壓力均質(zhì)3 min，形成最終乳液，測定乳狀液粒徑分布，來評估乳狀液的乳化活性。制成的乳狀液在4℃下儲存，24和168 h后取樣測定乳狀液粒徑分布，來評估乳狀液的穩(wěn)定性。

（2）乳狀液粒徑分布的測定：利用BT-9300ST激光粒度分布儀測定果膠乳液粒度分布情況，并記錄體積分?jǐn)?shù)平均粒徑（D4,3）。測定參數(shù)為散射角度90°，激光波長633 nm，溫度25℃，顆粒折射率1.596，顆粒吸收率0.001；分散劑為水，分散劑折射率1.333。

1.3.4 統(tǒng)計分析

所有試驗重復(fù)做3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。使用Origin 2019b 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯果膠的提取率及組成

堿法提取馬鈴薯果膠得率為10.92%，所得果膠呈深棕色粉狀固體，質(zhì)地較脆，這與冷凍干燥提取法有關(guān)。蛋白質(zhì)含量為6.21%，略高于同類型研究報道，這與堿性環(huán)境下提取使蛋白質(zhì)更大程度保留有關(guān)?；曳趾繛?.75%，符合添加劑類食品安全生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，DM 為0，DA 為3.43%，這是由于堿性環(huán)境下提取發(fā)生了皂化反應(yīng)產(chǎn)生的（表1）。

表1 稀堿法提取馬鈴薯果膠多糖得率和化學(xué)組成Table 1 Yield and chemical composition of potato pectin polysaccharide extracted by dilute alkali method

2.2 果膠多糖分子量的分布

采用高效凝膠尺寸排阻色譜法測定APP 的分子量分布，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品在色譜柱上的保留時間及分子量對數(shù)得到線性回歸方程（LgMw= 14.109-0.546 3x，R2= 0.940 3）。馬鈴薯果膠的分子量分布如表2所示。APP示差折光檢測曲線上有兩個組分峰，峰1 和峰2 的重均分子量（Mw）分別為1 358.4和67.5 kD，峰2組分比例高于峰1組分。

表2 馬鈴薯果膠的分子量分布Table 2 Molecular weight distribution of potato pectin

2.3 果膠中中性單糖和酸性單糖測定

APP單糖組成主要由半乳糖（451.95 mg∕g）、半乳糖醛酸（144.13 mg∕g）、阿拉伯糖（138.06 mg∕g）和鼠李糖（94.89 mg∕g）組成，同時還含有少量的木糖（27.45 mg∕g）和葡萄糖（29.15 mg∕g）及葡萄糖醛酸（7.25 mg∕g）（表3）。半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖是果膠中最原始的糖成分。與其他單糖相比，葡萄糖和木糖在提取的果膠多糖中的比例較低。葡萄糖主要來自于馬鈴薯渣殘留的淀粉。而半纖維素多糖，如木葡聚糖、異甘露聚糖和異木聚糖，是木糖的可能來源。

表3 APP的單糖組成Table 3 Monosaccharide composition of APP

2.4 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測定

APP 的FT-IR 譜圖如圖1所示。馬鈴薯果膠在400～4 000 cm-1具有果膠類化合物的特征吸收峰。在3 436 cm-1左右處發(fā)現(xiàn)了強而寬的峰，這可歸因于多糖分子內(nèi)O-H的伸縮振動；在2 935 cm-1左右處的吸收峰代表甲基（-CH3）和次甲基（-CH2）的CH 伸縮振動；1 741 cm-1左右的伸縮振動是由C=O共振產(chǎn)生，為醛基或乙?；?；在1 618 cm-1左右出現(xiàn)羧基的非對稱共振與1 418和1 334 cm-1的-COO-對稱共振，共同構(gòu)成了果膠中糖醛酸的特征結(jié)構(gòu)。對于馬鈴薯果膠，在1 741 cm-1處的吸收面積要弱于1 618 cm-1處的吸收面積，這表明他們是低甲氧基果膠。1 236 cm-1為果膠酯化的羧基上C=O的吸收峰，1 078 cm-1左右處的強吸收峰是糖苷鍵的C-O-C 的非對稱振動峰，為吡喃型糖的特征吸收峰。在891～952 cm-1的吸收峰表明有β-型糖苷鍵；在750～831 cm-1的吸收峰表明有α-型糖苷鍵。馬鈴薯果膠紅外光譜圖表明，APP具有多糖特征吸收峰。

圖1 馬鈴薯果膠紅外光譜圖Figure 1 FT-IR spectra of potato pectin

2.5 掃描電子顯微鏡（SEM）分析

馬鈴薯果膠凍干樣品的微觀結(jié)構(gòu)如圖2 所示。通過SEM 研究APP 表面形態(tài)顯示，APP 的表面呈片狀結(jié)構(gòu)，且表面平滑緊實。這與堿性環(huán)境提取及超濾濃縮制備果膠有關(guān)，不同提取方法對果膠分子微觀結(jié)構(gòu)影響較大。

圖2 馬鈴薯果膠的掃描電鏡圖Figure 2 Scanning electron microscope images of potato pectin

2.6 APP乳化特性分析

堿法馬鈴薯果膠乳化特性分析見圖3。乳化活性隨著果膠濃度的增加而減小。當(dāng)果膠濃度高于2.0%時，D4,3 值幾乎不受APP 濃度的影響，其乳液粒徑保持在1.473～1.693 μm。說明APP具有較好的乳化活性。

圖3 APP乳液乳化粒徑變化曲線Figure 3 APP emulsion particle size change curve

隨著貯存時間的延長，果膠濃度小于1%的乳狀液粒徑變化較為明顯；果膠濃度為1%時，乳液粒徑從0 h的3.576 μm 上升至168 h的5.231 μm。當(dāng)果膠濃度大于1.5%，乳液粒徑隨貯存時間的延長無顯著變化，說明APP 濃度大于1.5%，乳液穩(wěn)定性較好。

3 討 論

以馬鈴薯渣為原料，采用了低溫短時稀堿法提取馬鈴薯果膠。果膠的得率為10.92%，不含有甲酯化部分，乙酰化度為3.43%，蛋白質(zhì)含量為6.21%，灰分含量為3.75%，符合國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)。

順序酸堿法提取馬鈴薯果膠中酸法提取率為1.2%（表中未列出），對照直接堿法提取馬鈴薯果膠醇沉?xí)r沒有果膠析出，故選用酸處理后堿法提取馬鈴薯果膠。原因為初始用酸處理，可以更好地破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有利于果膠的堿法溶解[22]。試驗中，室溫稀堿法提取馬鈴薯果膠，條件較溫和，能夠更好地釋放完整的RG-I 果膠[13]。堿法提取具有更高的蛋白質(zhì)含量（6.21%），推測是因為蛋白質(zhì)具有更好的堿性環(huán)境適應(yīng)性，堿法果膠的灰分含量為3.75%，符合國家食品添加劑使用安全標(biāo)準(zhǔn)中的要求。但堿法提取的馬鈴薯果膠在甲酯化程度測量的核磁共振實驗中未檢出，乙?；潭纫矁H有3.43%，這可能是因為在堿性環(huán)境下提取果膠時發(fā)生了皂化反應(yīng)，使得最終的提取結(jié)果幾乎不含有甲氧基，這與文獻(xiàn)報道基本一致[17]。

單糖組成分析表明，主要由半乳糖（451.95 mg∕g）、半乳糖醛酸（144.13 mg∕g）、阿拉伯糖（138.06 mg∕g）和鼠李糖（94.89 mg∕g）組成。馬鈴薯果膠主要由支化的RG-I 結(jié)構(gòu)域組成，且其半乳聚糖側(cè)鏈含量高于阿拉伯聚糖側(cè)鏈。堿法馬鈴薯果膠的中性糖含量高于酸性糖含量，因為在堿性和中性條件下中性糖側(cè)鏈完整，沒有降解[23]。APP中半乳糖和GalA是所有馬鈴薯果膠的主要成分，且半乳糖含量高于GalA含量。而蘋果果膠和甜菜果膠的GalA含量均在50%以上[22]。HG 結(jié)構(gòu)域的主要成分為GalA，而RG-I 結(jié)構(gòu)域主鏈由Rha 和GalA 交替連接構(gòu)成，Rha∕GalA 的摩爾比值常用來反映RG-I 結(jié)構(gòu)的多少，以RG-I 結(jié)構(gòu)為主的果膠多糖Rha∕GalA 值在0.05～1，比值越接近1 則果膠多糖組分中RG-I 結(jié)構(gòu)占比越多，HG 結(jié)構(gòu)越少[17]。APP 的Rha∕GalA 比值為0.66，比值較大，表明APP 以RG-I 結(jié)構(gòu)域為主。但這一比值低于文獻(xiàn)報道的馬鈴薯果膠（0.81）[17]，這是由于高溫較強的堿法提取過程中HG 結(jié)構(gòu)域因β-消除作用被大量水解[13]，導(dǎo)致HG結(jié)構(gòu)域占比下降；而本研究采用的低溫短時弱堿法對HG結(jié)構(gòu)域水解較弱，致使APP的Rha∕GalA比值略低。半乳糖和阿拉伯糖是RG-I 結(jié)構(gòu)域側(cè)鏈，APP 的Gal∕Ara 比 值 為4.76，低 于 文 獻(xiàn) 中 報 告 值（6.6）[13]。較高Gal∕Ara 比值證實了馬鈴薯果膠的半乳聚糖側(cè)鏈高于阿拉伯聚糖側(cè)鏈[24]。此外，APP的Gal∕Rha 比值為2.73，高Gal∕Rha 比值表明馬鈴薯果膠多糖具有高度分支，且存在短的RG-I 主鏈結(jié)構(gòu)[13]。

分子質(zhì)量分析結(jié)果表明，APP有分子量分別為1 358.4 和67.5 kD 的2 個組分。這些結(jié)果表明，在NaOH 溶液中果膠多糖HG 有一定的降解率。這與文獻(xiàn)報道一致[16,25]。高分子量組分可能是具有與RG-II交聯(lián)和高比例HG的RG-I，而低分子量組分是具有小比例HG的RG-I組分[13]。

紅外分析結(jié)果表明，APP具有明顯的果膠類物質(zhì)特征官能團(tuán)；用SEM 掃描成像顯示固體表面呈片狀結(jié)構(gòu)。APP看起來非常堅硬，說明果膠分子間存在強的作用力。這與文獻(xiàn)報道相似[26]。

乳化性能結(jié)果表明，堿法馬鈴薯果膠具有良好乳化性，這一數(shù)據(jù)與大豆可溶性多糖乳液粒徑（1.50 μm）接近[27]，并且乳化能力隨果膠添加量增加而增大，APP 濃度大于1.5%乳液穩(wěn)定性較好。APP 的乳化活性可能是由于蛋白質(zhì)部分（6.21%）所致[28]。雖然大量的中性糖側(cè)鏈會阻礙乳化過程，但其可以通過在油滴上形成厚厚的水合層，從而改善APP的乳液穩(wěn)定性，防止油顆粒聚集[25]。

較溫和的低溫短時稀堿法提取馬鈴薯果膠由支化的RG-I 結(jié)構(gòu)域組成，且具有較好的乳化性能，有可能成為食品加工業(yè)中具有生理活性的乳化劑。