鄔學清 高曉博 金 宏

（集寧師范學院 化學與化工學院，內蒙古 烏蘭察布 012000）

1 引言

1.1 研究意義

目前，食品安全問題備受社會矚目，而食品添加劑含量也是關注點。其中苯甲酸、山梨酸是食品中常用的添加劑和防腐劑[1]。苯甲酸是酸型食品防腐劑的一種，能抑制霉菌、酵母和細菌在酸性條件下的生長[2]。山梨酸也能抑制霉菌、酵母菌和好氧性細菌的生長活性，二者都能達到食品防腐目標，但是兩者均不能食用過多和經(jīng)常食用，否則會影響人體健康[3]。

根據(jù)資料，苯甲酸慢性中毒會導致頭痛、暈眩、記憶力急劇下降、失眠、乏力、神經(jīng)衰弱等癥狀；有的可能會導致體內免疫細胞數(shù)量降低，造成再生障礙性貧血[4]。一般認為，適量添加苯甲酸并不會在人體形成積累，是相對安全的。但是，苯甲酸能損壞細胞膜有序結構，使細胞膜的功能發(fā)生紊亂，干擾細胞內的各種平衡機制，使人體內各組織系統(tǒng)功能紊亂，出現(xiàn)嘔吐、腹痛和心率變快等嚴重征狀[5]，所以食品、飲品相對安全不可忽略；雖然山梨酸（鉀）能夠對霉菌、酵母菌和好氧性細菌的活性產生抑制作用，還能防止肉毒桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌等有害微生物的生長和繁殖[6]。但是經(jīng)常食用含有過量山梨酸的飲品，在一定情況下會抑制骨骼生長，對腎臟和肝臟造成損傷[7]。目前已經(jīng)將山梨酸列入國家食品安全檢測項目。

飲品是以水為原料，用不同配方制作而成供人們經(jīng)常飲用的液體食品，不同的成分飲料對人體有著不同的作用，有的以補充人體水分為主，有的以緩解人體疲勞為主，有的含有豐富的維生素，有的還具有抗疲勞作用[8]。它的制作原料有蔬菜、水果、乳品類等，商家為保障儲存、運輸會適當加入防腐劑和添加劑，由此市場飲品有可能存在安全隱患。苯甲酸和山梨酸是飲品生產一般防腐劑，GB2760-2008 中明確規(guī)定飲料類山梨酸最大使用量0.5 g/kg、苯甲酸最大使用1 g/kg[9]，可見對不同飲品苯甲酸和山梨酸的檢測是食品安全檢測的重要項目[8]。

1.2 研究現(xiàn)狀及目的

如今，對于飲料中的苯甲酸和山梨酸含量的測定方法有多種，其中主要有高效液相色譜法和氣相色譜法[9]。色譜法準確度高，但除了使用儀器價值高之外，還由于使用色譜柱填充料和流動相的特殊，使檢測成本較高。梁奇峰教授等應用的比值倒數(shù)光度法，在不經(jīng)分離的情況下，同時測得吸收光譜重疊嚴重的苯甲酸和山梨酸兩組分的含量，此方法使用儀器簡單，操作方便，廣泛用于苯甲酸、山梨酸含量測定，但是數(shù)據(jù)處理復雜[10]。針對以上情況，對市場上不同飲品中的苯甲酸及山梨酸進行了抽樣檢測，一方面了解市場供應產品的質量安全指標，另一面為相關食品檢測機構提供方便、經(jīng)濟、適用的檢測方法。

1.3 研究思路及方法

苯甲酸具有芳烴結構，其吸收光譜在波長228 nm和272 nm處有K吸收帶和B吸收帶，且在非極性溶劑中B吸收帶具有精細結構，隨溶劑極性增大吸收帶以一定的規(guī)律發(fā)生變化。山梨酸具有α、β不飽和羰基結構，在250 nm處有π躍遷的K吸收帶[11]。綜上所述，可以通過繪制物質溶液的紫外吸收光譜圖，并在相同條件下與標準物光譜圖進行比對，從而進行定性、定量分析。由于苯甲酸在水中溶解度小，而且容易升華；山梨酸難溶于水，所以本實驗通過乙醚萃取和恒溫蒸餾純化飲品中的苯甲酸和山梨酸，在堿性條件下使其轉化為可溶性的鈉鹽，利用紫外吸收分光光度法繪制它們的吸收光譜，確定最佳測定波長，利用分光光度法中的外標法定量測定苯甲酸和山梨酸的含量。

2 實驗部分

2.1 主要儀器及試劑

756S 型紫外可見分光光度計（上海棱光技術有限公司），F(xiàn)A2204B 電子天平（上海精密科學儀器有限公司），HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司），分液漏斗，蒸餾裝置等儀器。

碳酸氫鈉（分析純），天津市化學制劑三廠；苯甲酸（分析純），天津市風船化學試劑科技有限公司；山梨酸（化學純），國藥集團化學試劑有限公司；乙醚（分析純），上海馬陸制藥廠；氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；無水硫酸鈉（分析純），天津市塘沽鄧中化工廠。

2.2 溶液的配制

2%的NaHCO3配制：稱取40 g NaHCO3溶解稀釋到2000 mL 作為溶劑。

82.4 mg/L 苯甲酸標準儲備液的配制：稱取苯甲酸0.0206 g 于50 mL 燒杯中，以2% NaHCO3溶解轉移至250 mL 容量瓶中準確定容，待用。

25.0 mg/L山梨酸標準儲備液的配制：精確稱取山梨酸0.0625 g置于50 mL燒杯中，以2%NaHCO3為溶解轉移至250 mL 容量瓶中準確定容，為250 mg/L 標準儲備液，再準確移取山梨酸標準儲備液10mL 準確稀釋到100 mL 待用。

苯甲酸系列標準溶液的配制：分別移取1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL 的苯甲酸儲備液于5 個50 mL 的容量瓶中，然后用2%的NaHCO3溶液定容至刻度，搖勻，靜置，得到苯甲酸系列標準溶液（濃度間隔為1 mg/L）。

山梨酸標準系列溶液的配制：分別移取0.50 mL；1.00 mL；1.50 mL；2.00 mL；2.50 mL 的山梨酸儲備液于5 個50 mL 的容量瓶中，然后用2%的NaHCO3溶液定容至刻度，搖勻，靜置，得到山梨酸系列標準溶液（濃度間隔為0.5 mg/L）

苯甲酸-山梨酸的混合溶液的配制：移取苯甲酸B1(1.00 mL)；B2(2.00 mL)；B3(3.00 mL)；B4(4.00 mL)；B5（5.00 mL）至50 mL 容量瓶中，按照下表移取山梨酸S1(0.50 mL)；S2(1.00 mL)；S3(1.50 mL)；S4(2.00 mL)；S5(2.50 mL)至相應的50 mL 容量瓶中，用2%% NaHCO3定容至刻度，搖勻，作為標準混合系列溶液，待用。

2.3 樣品的來源

隨機購買商品飲料：怡泉檸檬味汽水（2018.8.17）可口可樂公司；浩明蘇打水（2018.5.30）北京浩明品牌管理有限公司；可樂（2018.11.16）可口可樂公司；雪碧（2018.8.13）可口可樂公司；美年達（青蘋果味2018.8.17）百事公司。

2.4 實驗方法

2.4.1 樣品中苯甲酸、山梨酸的提取

取2.3 中各樣品20.00 mL，放于小燒杯中加入1mL 的HCl(6 mol/L)酸化，然后放置在250 mL分液漏斗中，依次用30 mL、20 mL、20 mL 的乙醚各萃取一次，每次萃取后都靜置5 分鐘。待分液漏斗中靜置分層，將上層乙醚提取液轉移到小燒杯中。合并3 次萃取液用5mL 的HCl 和NaCl 混合溶液洗滌，然后加入適量的無水硫酸鈉用作吸收殘余水份，攪拌，恒溫加熱到40℃，45 分鐘后將其中殘留乙醚蒸發(fā)出去，用2.0% NaHCO3 溶液溶解，移至100 mL 容量瓶中定容，待用。

表1 山梨酸苯甲酸混合系列溶液

2.4.2 樣品中苯甲酸含量的檢測

移取苯甲酸1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL 分別放置在5 個50 mL 的容量瓶，再分別依次準確滴加山梨酸1.00 mL，用2% NaHCO3定容。利用雙波長分光光度法，在測定λ2 為230 nm；參比λ1 為276 nm 的條件下，繪制測定苯甲酸的標準曲線，線性方程為c=10.0695A-0.2677；相關系數(shù)r 為0.9995；線性范圍為1.6 mg/L～8.0 mg/L；檢出限量0.028 mg/L。準確移取2.4.1 中處理好的各樣品提取液直接測量或稀釋5 倍后測量其吸光度并計算其濃度。

2.4.3 樣品中山梨酸含量的檢測

移取山梨酸0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 分別放置在5 個50 mL 的容量瓶，再分別依次準確滴加苯甲酸3.00 mL，用2% NaHCO3定容。利用雙波長分光光度法，在測定λ2 為255 nm；參比λ1 為276nm 的條件下，繪制測定山梨酸的標準曲線，線性方程為c=6.5135A+0.1726；相關系數(shù)r 為0.9999；線性范圍為0.25 mg/L～5 mg/L；檢出限量0.04 mg/L。準確移取2.4.1 中處理好的各樣品提取液直接測量或稀釋5 倍后測量其吸光度并算出其濃度。

3 結果與討論

3.1 吸收光譜的繪制

用2% NaHCO3 溶液作為參比，分別測定苯甲酸、山梨酸系列標準溶液以及二者系列混合溶液的紫外吸收光譜（掃描范圍為200～300 nm，波長間隔為1 nm，掃描速度為中速，掃描間隔為0.5 nm）。根據(jù)光譜圖的峰值變化或光譜圖比較確定苯甲酸、山梨酸的定量測定波長。具體見圖1 至圖9。

3.1.1 苯甲酸測定波長的確定

由圖1、圖2可知，隨濃度的增大苯甲酸系列標準溶液的最大吸收波長有藍移現(xiàn)象，而山梨酸的最大吸收波長隨濃度增大無變化，苯甲酸的最大吸收波長225 nm處山梨酸有負吸收，在山梨酸的最大吸收波長255 nm處苯甲酸有正吸收，可見它們在最大吸收波長處都各有相互干擾，所以不能在它們最大吸收波長處進行分別測定。根據(jù)雙波長分光光度法，吸收光譜相互重疊的兩組份共存時可測定一種物質，而把另一種物質作為干擾物，所以在苯甲酸的測定波長處找山梨酸的等吸收波長。由圖3可知，山梨酸在苯甲酸的最大吸收波長處有負吸收，難以確定等吸收波長；根據(jù)系數(shù)倍率法的原理也無法確定合適的參比波長[12]，而在苯甲酸吸收波長227 nm處有山梨酸的等波長點，但是隨苯甲酸含量的變化，吸光度變化不均勻。由圖2、圖4、圖5、圖6可知，在230 nm處吸光度隨苯甲酸濃度均勻變化，在276 nm處吸光度隨山梨酸濃度的均勻變化而變化，因此苯甲酸測定可利用230 nm為測定波長，276為參比波長；以系列混合溶液繪制標準曲線進行苯甲酸含量測定。所有混合系列所得線性方程相關性很好，線性方程的斜率和截距相差不大，具體見表2。

3.1.2 山梨酸測定波長的確定

根據(jù)吸收光譜相互重疊的兩組份共存時，雙波長測定規(guī)則，測定山梨酸，把苯甲酸作為干擾；山梨酸的最大吸收波長處苯甲酸的等吸收波長有286 nm、225 nm，具體見圖3。根據(jù)雙波長選擇規(guī)則，當兩波長距離相近時，可認為背景吸收是相等[12]，待測組份吸收差最大。所以選擇測定波長是255 nm，參比波長為286 nm，測定山梨酸系列溶液吸光度，并繪制標準曲線，顯示線性方程相關性極差；由圖7、圖8、圖9可知在255 nm處山梨酸的吸光度隨均勻濃度變化。在276 nm處苯甲酸吸光度也隨濃度均勻變化，因此，選擇山梨酸的測定波長255 nm，參比波長276nm進行多組份混合液中山梨酸的測定，測定系列混合溶液吸光度，并分別繪制標準曲線，各線性方程的斜率、截距基本相同，相關系數(shù)符合分析測定一般要求，具體見表2。

表2 線性方程及相關系數(shù)的比較（X=1、2、3、4、5）

3.2 樣品中苯甲酸、山梨酸的測定

用2.4.1的提取方法對五種樣品各取兩份提取處理后，用2.4.2、2.4.3苯甲酸和山梨酸的測定方法，對每一提取液各平行測定5次，同一樣品的兩份測定結果通過F、t檢驗都不存在顯著性差異（95%的置信度），所以數(shù)據(jù)處理結果為兩份提取液的平均值，利用合標準偏差進行精密度分析，即測定次數(shù)為10，自由度為8計算合標準偏差[13]；將B3+S3苯甲酸與山梨酸混合液在相應的線性方程下進行3次準確度測定，苯甲酸相對誤差為+2.2%、山梨酸的誤差是+9.3%（真值：苯甲酸4.94 mg/L山梨酸0.75 mg/L），結果見下表3。將各種飲料密度以1g/mL折算計算，五種飲料中防腐劑苯甲酸、山梨酸均無超標。測定方法供飲品質量檢測參考使用或進一步驗證。

表3 樣品測定數(shù)據(jù)及結果分析