馬瑜蔓 牛思源 喬寧 蘇之涵 劉彩虹 任琴*

（集寧師范學(xué)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

1 前言

土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的資源和生態(tài)問(wèn)題。全球鹽堿地面積已達(dá) 9.5×108hm2（公頃）。中國(guó)鹽漬土總面積約 1 億公頃，其中現(xiàn)代鹽漬化土壤約 0.37 億公頃，殘余鹽漬化土壤約 0.45 億公頃，潛在鹽漬化土壤約 0.17 億公頃。據(jù)聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署（UNEP）的調(diào)查統(tǒng)計(jì)，在旱地土壤退化中，因土壤鹽漬化造成的土地荒漠化達(dá) 110 萬(wàn)公頃以上，僅次于風(fēng)蝕和水蝕，居第三位。全世界可耕地面積的20%和灌溉面積的50%均受到不同程度次生鹽漬化的影響。土壤鹽漬化抑制種子的萌發(fā)及作物的生長(zhǎng)，使栽培作物的產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1]。土壤鹽漬化這一古老的生態(tài)災(zāi)難再一次向人類(lèi)發(fā)出了嚴(yán)峻警告[2]。

上世紀(jì)80 年代以來(lái)，我國(guó)在改造鹽堿地，尤其在生物改良方面，各地均有許多成功的經(jīng)驗(yàn)。如：內(nèi)蒙古河套黃河灌區(qū)向日葵產(chǎn)區(qū)，羊草和堿茅是鹽堿化草地上的優(yōu)勢(shì)植物，在松嫩平原上已得到應(yīng)用推廣。遼寧在重鹽漬化地區(qū)栽培細(xì)葉藜，為養(yǎng)豬提供了優(yōu)質(zhì)青飼料。天津農(nóng)科院耐鹽水稻試驗(yàn)，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)在河北省曲周淺層咸水型鹽堿化低產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了30 年的改良實(shí)驗(yàn)，使當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)作物產(chǎn)量獲得了很大的提高。利用鹽生植物改造鹽堿地的效果也比較明顯，如東營(yíng)鹽生植物園。本文通過(guò)對(duì)鹽脅迫下綠豆種子的發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度及抗氧化酶活性的研究，旨在為植物的抗鹽性提供科學(xué)依據(jù)。

已有研究表明，植物的耐鹽性是由多基因控制的復(fù)合性狀，并且是一系列的整體適應(yīng)性，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物抗鹽性的研究已取得了一定的進(jìn)展，某些植物的抗鹽性得到了很大的提高[3]。在植物遭受生物和理化因子傷害時(shí)，膜上受體接受并傳遞脅迫信號(hào)，引發(fā)質(zhì)膜和細(xì)胞器的氧化猝發(fā)產(chǎn)生ROS，ROS 在傳送和放大信號(hào)的過(guò)程中會(huì)改變離子的分布和啟動(dòng)核基因的表達(dá)，從而使植物耐受各種脅迫。同時(shí)過(guò)氧化氫酶通過(guò)清除作用ROS 保持一定的濃度范圍，過(guò)氧化氫酶的這種保護(hù)機(jī)制，也體現(xiàn)在植物各種抗逆反應(yīng)中[4]。

植物在脅迫條件下，為了保護(hù)自身，能夠產(chǎn)生許多抗性物質(zhì)，從而抵御逆境的危害，以獲得更好的生存環(huán)境。不同植物的抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)不同，雖然植物在受到脅迫時(shí)能夠啟動(dòng)自身的酶系統(tǒng)來(lái)抵御不良環(huán)境，但也僅限于一定的脅迫范圍內(nèi)，當(dāng)鹽濃度過(guò)大時(shí)會(huì)對(duì)植物造成傷害，酶活性下降[5]。高昆等研究表明，不同濃度NaCl 處理錦燈籠后，其POD 活性隨著NaCl 濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì)[6]。馮梅等研究表明，低濃度的鹽脅迫可增強(qiáng)POD、CAT 活性，以此減弱體內(nèi)有害物質(zhì)CAT 的活性，隨著鹽濃度的增加，CAT 活性逐漸減弱[7]。陳忠祥在NaCl 脅迫對(duì)不同貯藏期羅布麻種子萌發(fā)及幼苗生理的影響中指出，隨著NaCl 濃度增加，羅布麻幼苗期POD、CAT 酶活性均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)[8]。然而系統(tǒng)研究鹽濃度脅迫對(duì)綠豆種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響報(bào)道甚少。本文以烏蘭察布雜糧綠豆種子為材料，探討不同鹽濃度對(duì)其種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響，篩選出最佳鹽濃度，旨在為作物抗鹽性提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

試驗(yàn)所用綠豆購(gòu)自烏蘭察布市集寧區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

2.2 方法

2.2.1 鹽脅迫下綠豆種子的發(fā)芽率及胚根長(zhǎng)度測(cè)定

（1）選取大小均勻的綠豆種子450 粒。每個(gè)培養(yǎng)皿中分別放入兩層濾紙。取干凈的15 個(gè)培養(yǎng)皿編號(hào)為1～15，其中1～3 號(hào)培養(yǎng)皿中倒入濃度為0.0 mmol/L 氯化鈉溶液，4～6 號(hào)倒入濃度為100 mmol/L 氯化鈉溶液，以此類(lèi)推，每個(gè)處理重復(fù)3 次。每個(gè)培養(yǎng)皿放入30 粒綠豆種子，蓋上紗布，注意保持紗布的濕潤(rùn)，放入恒溫培養(yǎng)箱中。

（2）于1、3、5、7、9 天觀察其發(fā)芽率并測(cè)量胚根長(zhǎng)度。

2.2.2 抗氧化酶活性的測(cè)定

（1）抗氧化物酶粗酶液的提取

從上述各培養(yǎng)皿中隨機(jī)挑選出綠豆，稱(chēng)取其樣品重量加以記錄，分別加入磷酸緩沖溶液（20 mmol/L，pH 值為6.0）研磨成勻漿狀，定容至5 mL，于4000 r/min 離心15 min，上清液即為粗酶提取液。

（2）過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定

采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。具體為，吸取1 mL 提取液于試管中，加入3 mL 反應(yīng)混合液（50 mL 磷酸緩沖溶液，加入愈創(chuàng)木酚28 μL，30%過(guò)氧化氫19 μL），以磷酸緩沖溶液為空白對(duì)照，立即測(cè)定每30 s（秒），470 nm 波長(zhǎng)下光OD 值，共測(cè)2 min。

過(guò)氧化物酶活性（OD/g*FW）=[OD470 值/樣品鮮重（g）]

（3）過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定

取上述各處理中的粗酶提取液0.2 mL 于試管中，加入2.8 mL 反應(yīng)混合液（pH 值為7.8 磷酸緩沖溶液1.5 mL，加入100 mmol/L 30%過(guò)氧化氫0.3 L 和1 mL 蒸餾水），以蒸餾水為空白對(duì)照，立即測(cè)定每分鐘240 nm 波長(zhǎng)下光OD 值，共測(cè)4 min。

過(guò)氧化氫酶活性（μ/(g*FWmin)）=（ΔA240*Vt）/（W*Vs*0.01*t）

式中，Vt 為提取酶液總體積（mL）； W 為綠豆鮮重（g）； Vs 為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）；t 為反應(yīng)時(shí)間（min）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同鹽濃度脅迫對(duì)綠豆種子發(fā)芽率的影響

圖1 為不同鹽濃度脅迫對(duì)綠豆種子發(fā)芽率的影響。結(jié)果表明，處理濃度為0 mmol/L、100 mmol/L的條件下，各組內(nèi)綠豆發(fā)芽率均為100%。處理濃度為200 mmol/L、300 mmol/L 條件下，各組內(nèi)綠豆發(fā)芽率隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)芽率明顯上升。鹽濃度為200 mmol/L 處理?xiàng)l件下，第9 天種子發(fā)芽率

圖1 不同鹽濃度脅迫對(duì)綠豆種子發(fā)芽率的影響

雖有所下降，但方差分析結(jié)果顯示，與對(duì)照無(wú)顯著差異。同一處理天數(shù)不同濃度對(duì)綠豆種子萌發(fā)影響不同。與對(duì)照0 mmol/L 相比，100 mmol/L 處理與對(duì)照組無(wú)顯著差異。當(dāng)鹽濃度為200 mmol/L 時(shí)，第1 天和第3 天綠豆種子發(fā)芽率顯著低于同天對(duì)照，但5—7 天發(fā)芽率提高，與對(duì)照無(wú)顯著差異。當(dāng)鹽濃度為300 mmol/L 和400 mmol/L 時(shí)，綠豆種子發(fā)芽率顯著低于同天對(duì)照發(fā)芽率。

3.2 不同鹽濃度脅迫對(duì)綠豆胚根長(zhǎng)度的影響

圖2 為不同鹽濃度對(duì)綠豆種子胚根長(zhǎng)度的影響。結(jié)果表明，同一鹽濃度對(duì)綠豆種子發(fā)芽率影響不同，隨著胚根生長(zhǎng)天數(shù)增加。0 mmol/L 和100 mmol/L 鹽濃度條件下，綠豆種子胚根長(zhǎng)度顯著增加。處理濃度為200 mmol/L 和300 mmol/L 鹽脅迫條件下，胚根長(zhǎng)度在第1、3、5 天不斷增加，5天后長(zhǎng)度基本不再增加。鹽濃度為400 mmol/L 時(shí)，綠豆胚根基本不長(zhǎng)。不同濃度同一時(shí)間，綠豆胚根長(zhǎng)度變化不同。與對(duì)照相比，同一天中100 mmol/L 和200 mmol/L 處理均顯著降低了胚根長(zhǎng)度。

圖2 不同鹽濃度脅迫對(duì)綠豆胚根長(zhǎng)度的影響

鹽濃度大于300 mmol/L 時(shí)，胚根幾乎不長(zhǎng)。

3.3 不同鹽濃度脅迫對(duì)綠豆抗氧化酶活性的影響

不同鹽濃度對(duì)POD 活性的影響如圖3。結(jié)果表明：當(dāng)鹽濃度在0～200 mmol/L 時(shí)，POD 均在處理第7 天達(dá)到最高，鹽濃度為300～400 mmol/L 時(shí)，POD 活性在第3 天達(dá)到最高，但總體各時(shí)間點(diǎn)酶活性升高較慢。不同濃度同一天處理下，POD 活性在0 mmol/L、100 mmol/L 脅迫下變化趨勢(shì)基本相同，當(dāng)鹽濃度為200 mmol/L 時(shí)，POD 活性變化變小。300 mmol/L 后基本無(wú)變化。

圖3 不同鹽濃度脅迫對(duì)綠豆過(guò)氧化物酶活性的影響

不同鹽濃度對(duì)CAT 活性的影響如圖4。結(jié)果表明：不同天數(shù)相同鹽濃度中CAT 活性變化除400 mmol/L 外，其余濃度組內(nèi)均呈波浪式下降上升，而處理濃度為400 mmol/L 條件下，過(guò)氧化氫酶活性組內(nèi)呈先上升后下降趨勢(shì)。在處理濃度為0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L 條件下脅迫3 天后，綠豆種子內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性與1 天相比下降，方差分析結(jié)果顯示差異不顯著；脅迫5 天，綠豆種子內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性與脅迫1 天相比顯著升高。

圖4 不同鹽濃度脅迫對(duì)綠豆過(guò)氧化氫酶活性的影響

4 結(jié)論與討論

與對(duì)照組相比，當(dāng)鹽濃度為100 mmol/L 時(shí)，種子發(fā)芽率與對(duì)照組相同，達(dá)到100%，胚根長(zhǎng)度隨培養(yǎng)天數(shù)延長(zhǎng)而增加，但低于對(duì)照組。過(guò)氧化物酶活性在第7 天達(dá)到最高，過(guò)氧化氫酶活性在第5 天達(dá)到最高。當(dāng)鹽濃度達(dá)到200 mmol/L 時(shí)，與對(duì)照組相比，種子發(fā)芽率隨培養(yǎng)天數(shù)增加而增長(zhǎng)，低于對(duì)照組，最高為93.75%，胚根長(zhǎng)度有所增加，但增長(zhǎng)幅度很小，CAT 活性在5 天達(dá)到最高。當(dāng)鹽濃度達(dá)到300 mmol/L 時(shí)，發(fā)芽率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低，最高僅為32.50%，CAT 活性在第5天達(dá)到最高。當(dāng)鹽濃度為400 mmol/L 時(shí)，種子基本不發(fā)芽，發(fā)芽率僅為1.25%，胚根生長(zhǎng)停滯，CAT活性在第3 天達(dá)到最高，此后天數(shù)中逐漸降低。

王建科等研究得出，同種鹽脅迫下隨著鹽濃度升高，種子萌發(fā)受到顯著抑制[9]。劉順平在研究不同濃度NaCl 處理對(duì)綠豆種子萌發(fā)的影響顯示，種子在萌發(fā)過(guò)程中出芽階段表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，在50～200 mmol/L 的NaCl 鹽脅迫下對(duì)其發(fā)芽率影響不明顯，但顯著抑制幼苗生長(zhǎng)，隨處理濃度的升高，其萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)受到抑制的程度不斷增大，綠豆種子萌發(fā)能忍耐的NaCl 處理濃度為200 mmol/L以下[10]。這與本實(shí)驗(yàn)基本一致。但王麗艷研究表明，除低濃度的NaCl（50 mmol/L）對(duì)綠豆種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，所有種類(lèi)所有濃度的鹽脅迫對(duì)綠豆種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用[11]。而本實(shí)驗(yàn)中綠豆可適應(yīng)100 mmol/L NaCl 鹽脅迫，這可能是由于試驗(yàn)所選用綠豆種子種類(lèi)不同，也可能是由于50～100 mmol/L 間濃度變化不大，因而導(dǎo)致結(jié)果不同。劉微等在研究NaCl 脅迫對(duì)辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響表明，隨著NaCl 濃度的升高，3 個(gè)辣椒品種的發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在萌發(fā)過(guò)程中辣椒種子僅可適應(yīng)低于200 mmol/L NaCl 的鹽脅迫[12]。這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果具有一致性。但鑒于二者研究種類(lèi)不同，因此綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)所適應(yīng)的脅迫濃度有待進(jìn)一步研究。

本研究中，POD酶活性在100 mmol/L內(nèi)，7天達(dá)到最高，CAT酶活性1天即達(dá)到最高。而李志萍研究得出，CAT活性在NaCl脅迫下呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，NaCl處理在400 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值[13]。這與本研究略有不同，可能與試驗(yàn)品種有關(guān)，亦或是試驗(yàn)時(shí)測(cè)定CAT酶活性時(shí)間不同。周玉梅等用NaCl模擬鹽害環(huán)境，研究苦豆子種子萌發(fā)過(guò)程中對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的生理特性變化規(guī)律，得出低濃度的鹽溶液引起POD與CAT活性極顯著或顯著上升，中度鹽脅迫（100 mmol/L＜NaCl溶液≤200 mmol/L）下，POD活性顯著下降，重度鹽脅迫（NaCl溶液＞200 mmol/L）下，CAT酶活性顯著上升，同時(shí)在重度鹽脅迫下POD酶活性已降至最低值，只有CAT酶還保持比較高的活性[14]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。宋玉偉等人研究發(fā)現(xiàn)綠豆幼苗隨著鹽脅迫濃度的增加和時(shí)間延長(zhǎng)，POD、CAT的活性都呈上升趨勢(shì)[15]。劉建霞等人研究發(fā)現(xiàn)，單鹽脅迫處理使POD活性下降，明顯低于對(duì)照組[16]。而本實(shí)驗(yàn)研究也表明，低濃度下POD活性隨濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)而升高，同時(shí)濃度為100 mmol/L下POD活性于第1天活性下降，此結(jié)果與宋玉偉、劉建霞的研究具有一致性。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明在濃度為200 mmol/L下，第3天CAT活性明顯低于第1天，此結(jié)果因?yàn)閮山M結(jié)果時(shí)間不同而有待驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明，綠豆可適應(yīng)的鹽濃度為100 mmol/L，當(dāng)鹽濃度高于100 mmol/L時(shí)綠豆種子的發(fā)芽率逐漸降低，胚根長(zhǎng)度生長(zhǎng)隨鹽脅迫增加而生長(zhǎng)緩慢，鹽濃度大于300 mmol/L時(shí)胚根幾乎不長(zhǎng)。抗氧化酶如過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶在鹽脅迫中發(fā)揮重要作用，隨鹽濃度的升高，POD活性逐漸降低，但總體各時(shí)間點(diǎn)酶活性升高，速度較慢；CAT活性保持較高活性。本實(shí)驗(yàn)為作物抗鹽性研究提供一定的理論依據(jù)，然而綠豆對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的生理機(jī)制尚未明確，因此本研究在今后的實(shí)驗(yàn)中將通過(guò)代謝組學(xué)深入研究。