劉宇，邱水霞，劉鳳嬌，朱宇珂，馬 成，李 莉*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西 太原 030031；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特市 010020；3. 中國科學(xué)院動物研究所農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理國家重點實驗室，北京 100101)

大豆(GlycinemaxL.Merrill)是重要的糧飼兼用作物，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)、油脂以及多種生物活性物質(zhì)，大豆蛋白含有人體必需的八種氨基酸，相較于動物蛋白具有低熱量、不含膽固醇等優(yōu)點，在我國農(nóng)業(yè)和人體膳食結(jié)構(gòu)中具有重要的不可替代性[1-3]。根據(jù)國家統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2019年我國大豆播種面積933萬公頃(1.4億畝)。然而，大豆病害帶來的一系列問題給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國已報道的大豆病害約40種，一般會造成10%～30%的減產(chǎn)，嚴(yán)重時可達(dá)>50%[4]。

苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)是一種三唑類內(nèi)吸性殺菌劑，具有高效、廣譜、安全、持效期長和內(nèi)吸性強等特性，主要通過抑制病原真菌細(xì)胞壁甾醇的生物合成而阻止其生長，對多種蔬菜和果樹上的葉斑病、黑斑病、白粉病及疫霉病等具有良好的防治效果[5]。苯醚甲環(huán)唑應(yīng)用廣泛，現(xiàn)已登記用于糧食作物、蔬菜、水果、觀賞花卉、草坪等61種作物。近年來，對其在西瓜[6]、芹菜[7]、枸杞[8]、甘藍(lán)[9]、香蕉[10，11]、桃[12]、葡萄[13]等農(nóng)產(chǎn)品中的殘留行為有一定的研究。

大豆生長過程中，青豆和大豆都是可食用部位。NY/T788-2018農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則中規(guī)定，在評價農(nóng)藥使用安全性時，田間試驗需采集青豆(帶莢)和大豆籽粒進(jìn)行檢測。過去的研究通過對杭州地區(qū)4個產(chǎn)地48個帶莢毛豆樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，其中13個樣品中苯醚甲環(huán)唑殘留量高于0.020mg/kg，最高達(dá)到0.126mg/kg[14]，造成一定的風(fēng)險。然而，對于苯醚甲環(huán)唑在青豆(帶莢)中的殘留水平尚未見報道。為此，本文應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了苯醚甲環(huán)唑在青豆(帶莢)和大豆中的殘留分析方法，測定了農(nóng)藥使用后青豆(帶莢)和大豆中殘留水平，為制定菜用大豆中的苯醚甲環(huán)唑的限量提供依據(jù)，同時，還討論了在代表性作物中的最大殘留限量差異，為我國大豆進(jìn)出口貿(mào)易中苯醚甲環(huán)唑的測定提供預(yù)警。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 試驗儀器：Waters TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；KQ-600超聲波清洗器；FC 5706臺式低速離心機(jī)；精密移液槍(Eppendorf)；HM294均質(zhì)機(jī)；CS-700高速粉碎機(jī)；MTV-100多管渦旋混合儀；CK2000高通量組織研磨儀。

苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品：純度96.3%，由Dr. Ehrenstorfer Gmbh提供；乙腈(色譜純)；甲酸(色譜純)；氯化鈉(分析純)。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 田間試驗設(shè)計 依據(jù)NY/T788-2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[15]和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《農(nóng)藥登記殘留試驗區(qū)域指南》(農(nóng)藥檢(殘留)[2018]18號[16]，于2020年在黑龍江省肇東市、內(nèi)蒙古烏蘭察布市、遼寧省沈陽市、山西省長治市、北京市昌平區(qū)、山東省泰安市、上海市松江區(qū)、安徽省宿州市、湖南省長沙市、廣西區(qū)南寧市進(jìn)行(各地的作物品種、氣候因子以及土壤屬性) (表1)。試驗作物為大豆，被試農(nóng)藥為200g/L氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑(只測定苯醚甲環(huán)唑)。

表1 田間實驗地點、作物品種、氣候因子及土壤條件

1.2.2 最終殘留試驗 按要求設(shè)計3個試驗小區(qū)：1個對照小區(qū)和2個處理小區(qū)，每個小區(qū)面積100m2，小區(qū)之間設(shè)保護(hù)行進(jìn)行有效隔離。施藥時期為青豆(帶莢)和大豆采收前21d，200g/L氟唑菌酰羥胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑(其中苯醚甲環(huán)唑125g/L)以240g.a.i./ha的劑量噴霧3次，施藥間隔期7d，于末次施藥后7、10、14d在青豆和大豆處理區(qū)分別采集青豆(帶莢)和大豆樣品，第1次和最后1次采集處理區(qū)樣品的同時采集青豆(帶莢)和大豆對照樣品。

1.2.3 樣品采集、制備與儲存 青豆(帶莢)樣本：將青豆田間樣本去除莖桿，保留豆莢，充分混勻，用四分法取150g裝入可封口樣品袋中，貼好標(biāo)簽后立即放入<-18℃冰箱中待測。

大豆最終：將大豆田間樣本去除枯葉、秸稈和外殼，充分混勻后，用四分法取150g裝入封口樣品袋中，貼好標(biāo)簽后立即放入<-18℃冰箱中待測。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品提取 大豆：準(zhǔn)確稱取粉碎后的大豆樣品10g(±0.05g)于50mL離心管中，加入乙腈10mL，甲酸0.1mL，超純水10mL，充分混勻，超聲提取15min，加入6g氯化鈉，高通量研磨儀震蕩1min，3 000r/min下離心5min，待凈化。

帶莢青豆：準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品5g(±0.05g)，加入乙腈10mL，甲酸0.1mL，超純水5mL，充分混勻，以下步驟同大豆樣品。

1.3.2 凈化 取1.7mL大豆樣品上清液加入裝有50mg C18+150mg MgSO4的2mL凈化管中，2 500r/min渦旋5min后高速離心機(jī)10 000r/min離心3min，上清液過0.22μm 濾膜后，待HPLC-MS/MS檢測。取1.7mL青豆(帶莢)樣品上清液加入裝有 50mg PSA+150mg MgSO4+50mg C18+10mg PC的2mL凈化管中，以下步驟同大豆樣品。

1.3.3 儀器條件 色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱溫：25℃；流速：0.4mL/ min；進(jìn)樣量：3μL；梯度洗脫條件(表2)。

表2 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源ESI；掃描方式：正離子源；毛細(xì)管電壓：3.0KV；錐孔電壓：25V；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：300℃；脫溶劑氣流量：650L/h；錐孔氣流量：0L/h；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；其他主要質(zhì)譜參數(shù)(表3)。

表3 苯醚甲環(huán)唑的主要質(zhì)譜參數(shù)

1.4 添加回收試驗 在空白樣品中添加4個水平苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)5次。添加水平為0.010、0.050、0.40、1.0mg/kg，按上述方法進(jìn)行分析，計算添加回收率及RSD。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)評價

(1)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect，簡稱ME)評價標(biāo)準(zhǔn)：(1)若ME≥20%，表明存在基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)采用基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)若ME<20%，表明基質(zhì)效應(yīng)可忽略，可采用純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法有效性評價 大豆和青豆(帶莢)樣品中苯醚甲環(huán)唑的分析方法基于QuEChERS方法建立，根據(jù)兩種基質(zhì)的不同特點，篩選出適合的分散固相萃取吸附劑，對方法的基質(zhì)效應(yīng)、正確度、定量限和重復(fù)性進(jìn)行了評價。在0.010～1.0mg/L范圍苯醚甲環(huán)唑在溶劑、大豆和青豆基質(zhì)空白液中的的質(zhì)量濃度(x)與峰面積(y)之間具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)(表4)。苯醚甲環(huán)唑在大豆中的基質(zhì)效應(yīng)ME值為-62%，在帶莢青豆中的基質(zhì)效應(yīng)ME值為-28%，因此，試驗中使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)，且基質(zhì)效應(yīng)顯著，因此本試驗樣品檢測使用大豆、青豆(帶莢)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

表4 苯醚甲環(huán)唑在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3的方法，在大豆樣品中，苯醚甲環(huán)唑的平均回收率為84%～96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～7.2%；在青豆(帶莢)樣品中，苯醚甲環(huán)唑的平均回收率為79%～89%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～7.8%，建立的分析方法在靈敏度，重復(fù)性等均可以滿足農(nóng)藥殘留檢測要求(表5)。

表5 苯醚甲環(huán)唑在各地青豆(帶莢)和大豆中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2 最終殘留量 按照苯醚甲環(huán)唑有效成分150g a.i./ha，噴霧3次，施藥間隔期7d，末次施藥后7、10、14d后采集青豆(帶莢)和大豆樣品，不同地區(qū)因耕作制度、用藥習(xí)慣、氣候條件等的差異，苯醚甲環(huán)唑在青豆(帶莢)和大豆上的殘留量有一定差異。采收間隔期為7、10、14d時，大豆中的殘留范圍分別為<0.01～0.085mg/kg、<0.01～0.057mg/kg、<0.01～0.086mg/kg。施藥7d后，黑龍江肇東、內(nèi)蒙古烏蘭察布、山西長治以及廣西南寧四產(chǎn)地中苯醚甲環(huán)唑在大豆中的最終殘留量分別為0.097、0.051、0.069、0.085mg/kg，均>0.05mg/kg；施藥10d后，黑龍江肇東、內(nèi)蒙古烏蘭察布兩產(chǎn)地的殘留量分別為0.057、0.051，均>0.05mg/kg；在施藥14d后，安徽宿州和廣西的殘留值為0.057和0.086mg/kg，>0.05mg/kg，高于我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2021中規(guī)定的MRL值0.05mg/kg(表7)。

苯醚甲環(huán)唑在10個不同地區(qū)的青豆(帶莢)中的最終殘留量(表6)，采收間隔期為7d時殘留量在0.24～1.67mg/kg，10d時為0.21～1.89mg/kg，14d時為0.12～1.65mg/kg。殘留量以廣西區(qū)南寧市和安徽省宿州市相對較高，可能與當(dāng)?shù)胤N植方式、大豆生長期有關(guān)。目前，我國GB2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中制定了菜用大豆(籽粒，去莢)的限量標(biāo)準(zhǔn)，但對于食品青豆(帶莢)未做規(guī)定。青豆(帶莢)經(jīng)加工處理、速凍冷藏后出口日本、歐美等國家，經(jīng)濟(jì)效益顯著[18]，然而，近年青豆(帶莢)出口因農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題引發(fā)的外貿(mào)退賠時有發(fā)生[14]，建議增加相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。

表6 苯醚甲環(huán)唑在各地大豆和青豆中的殘留量

2.3 MRL比對分析 不同國家或地區(qū)對農(nóng)作物中的殘留限量從數(shù)量和限量值方面都存在差異，從而可能影響國際貿(mào)易。張利真等對比了我國與國際食品法典委員會、歐盟、日本、韓國、美國等5個國家地區(qū)或組織關(guān)于毛豆(菜用大豆)中的最大殘留限量，我國標(biāo)準(zhǔn)中共有91種農(nóng)藥的限量值適用于菜用大豆；CAC標(biāo)準(zhǔn)涉及豆類蔬菜中15種農(nóng)藥的殘留限量值；歐盟法規(guī)涉及豆類蔬菜中408種農(nóng)藥的殘留限量值；美國在40 CFR 180中公布了豆類蔬菜中48種農(nóng)藥的殘留限量值[18]。

表7中對于苯醚甲環(huán)唑在部分農(nóng)作物中的最大殘留限量進(jìn)行了羅列、比較，其中，我國制定的玉米、草莓中苯醚甲環(huán)唑的限量均寬松與其他國家或組織，大豆和馬鈴薯中的最大殘留限量較其他國家或組織嚴(yán)格。對于農(nóng)作物中農(nóng)藥的規(guī)定寬松于其他國家或地區(qū)的情況，蔬菜生產(chǎn)者和貿(mào)易商除需符合我國規(guī)定最大殘留限量之外，還應(yīng)嚴(yán)格用藥管理和農(nóng)事操作，確保農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量符合進(jìn)口國(地區(qū))規(guī)定，保證出口貿(mào)易順利[19]；對于我國標(biāo)準(zhǔn)中限量嚴(yán)格于其他國家或地區(qū)的情況，應(yīng)加強監(jiān)管，進(jìn)口時農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全需符合我國的標(biāo)準(zhǔn)要求，以保障我國人民的膳食安全。

GB 2763-2021規(guī)定了564種農(nóng)藥在376種(類)食品中10092項最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[20]，為確保殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和適用性，建議農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)修訂工作結(jié)合實際生產(chǎn)、進(jìn)出口貿(mào)易等情況、以試驗數(shù)據(jù)為依據(jù)及時進(jìn)行更新[19]。

表7 部分農(nóng)產(chǎn)品中苯醚甲環(huán)唑最大殘留限量(MRL)值

3 結(jié)論

本實驗基于UPLC-MS/MS建立了苯醚甲環(huán)唑在大豆和帶莢青豆中的殘留檢測方法，該方法操作簡單，其準(zhǔn)確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留檢測要求，通過規(guī)范殘留試驗得到我國10個大豆主要生產(chǎn)區(qū)域青豆(帶莢)和大豆中的最終殘留水平，殘留量因地區(qū)、氣候、作物種類等存在差異，采樣間隔為7、10、14d時在青豆(帶莢)中和大豆的殘留量分別為0.24～1.67mg/kg、0.21～1.89mg/kg、0.12～1.65mg/kg，為我國制定苯醚甲環(huán)唑在菜用大豆中的MRL制定提供數(shù)據(jù)支持。在采收間隔期為14d時，大豆中的殘留量為<0.01～0.086mg/kg。通過對我國和其他國際組織和國家的最大殘留限量比對，為農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口和標(biāo)準(zhǔn)制定提出建議。