杜 鑫，彭海燕，覃明麗，陳紹輝，易珊珊，蔣金芳

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，四川 南充 637000)

草莓酸甜美味，果肉色澤紅潤(rùn)，富含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、糖分、有機(jī)酸、食物纖維及礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，深受消費(fèi)者喜愛，已成為廣大市民最普遍食用的水果品種[1]。草莓主要以大棚覆膜種植技術(shù)為主，棚內(nèi)高溫高濕環(huán)境極易引起病蟲害的發(fā)生，降低草莓的品質(zhì)和產(chǎn)量。噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿維菌素等殺蟲殺螨劑具有選擇性強(qiáng)、速效性好、持效期長(zhǎng)及對(duì)蜜蜂無(wú)不良影響等特點(diǎn)，已用于多種植物上防治紅葉螨、全抓蟠和其他植食性螨類，可用于防治大棚草莓生長(zhǎng)過(guò)程中的白粉病、霜霉病、二斑葉螨、小菜蛾及紅蜘蛛等病蟲害[2-4]。

目前，針對(duì)果蔬中農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[6]、氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法( GC-MS/MS)[7-8]、液相色譜法[9-10]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[4-5]，但氣相色譜法和液相色譜法易受雜質(zhì)干擾，且前處理繁瑣，GC-MS/MS常用于分析弱極性且具有一定揮發(fā)性的農(nóng)藥，不適用于檢測(cè)諸如阿維菌素等難以氣化的高沸點(diǎn)物質(zhì)。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS) 具有高分辨、抗干擾能力強(qiáng)及高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，QuEChERS被廣泛應(yīng)用于樣品基質(zhì)的提取、凈化，具有操作簡(jiǎn)易、溶劑用量少、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，兩者結(jié)合應(yīng)用已成為農(nóng)藥和獸藥多殘留分析的主導(dǎo)技術(shù)[11-12]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑 Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，GD16plus高速研磨均質(zhì)儀，H2100R 落地式高速冷凍離心機(jī)，Multi Reax全能型振蕩器、ML802型分析天平，3-18KS型高速冷凍離心機(jī)，Vortex Genius 3型旋渦混合器，JB3060食品調(diào)理機(jī)。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純，QuEChERS分散萃取試劑盒(5982-5056)及萃取鹽包(5982-0032)。噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿維菌素等4種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度均為1 000mg/L。15/50mL離心管，PTFE 0.22μm針筒式微孔濾膜，蒸餾水。

1.2 樣品制備 草莓(紅顏、巧克力、奶油、紅玉等)，取有代表性的草莓全果(去柄)樣品，采用四分法縮分后約1kg，放入料理機(jī)中，高速勻漿均質(zhì)后裝入潔凈的聚乙烯塑料樣品盒中，密封后于-20 ℃冰箱保存(使用前先解凍至室溫)。

1.3 樣品提取 準(zhǔn)確稱取10g(精確至0.01g)勻漿后的草莓樣品于50mL離心管中，依次加入1顆陶瓷均質(zhì)子，10.00mL乙腈，一袋萃取鹽包，擰緊離心管蓋，放入低溫(5℃)高速研磨均質(zhì)儀中3 000r/min均質(zhì)提取3min，然后5 000r/min離心3min，取上清液待凈化。

1.4 樣品凈化 吸取5mL上清液加到內(nèi)含900mg MgSO4+150mg PSA塑料離心管中，振蕩渦旋2min，5 000r/min離心3min，吸取2mL上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜后裝瓶，待上機(jī)測(cè)定。

1.5 儀器檢測(cè)條件

1.5.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(3.5μm，100mm×3.0mm)，柱溫40℃，樣品室溫度為18℃，進(jìn)樣體積為1.00μL；選用甲醇(A)、水(含0.10%甲酸—5mmol/L乙酸銨)(B)及乙腈(C)作為流動(dòng)相，按(表1)中的流動(dòng)相梯度洗脫程序分離目標(biāo)物。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源的溫度為150℃，毛細(xì)管電壓為3.0kV。脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)?，脫溶劑氣流量? 000L/h，其溫度為550℃，錐孔氣流量為150L/h，碰撞氣用高純氬氣，其流量為0.14mL/min。采用電噴霧正離子模式(ESI+)和選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)譜儀信號(hào)采集時(shí)間段為3.5～8.5min，利用質(zhì)譜已在線切換閥將其他時(shí)間段的液相色譜流動(dòng)相切換到廢液，降低質(zhì)譜檢測(cè)器污染。

表1 超高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確移取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，用色譜級(jí)乙腈逐級(jí)稀釋成濃度為10mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃下避光儲(chǔ)存(使用前放至室溫)。將篩選出的草莓空白樣品按前處理方法制成基質(zhì)空白溶液，用該溶液逐級(jí)稀釋10mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.005、0.010、0.050、0.10、0.20mg/L一系列匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化 將4種農(nóng)藥分別用乙腈-水(1：1，V：V)配制成0.5mg/L濃度的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液。選取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)為流動(dòng)相。在ESI+電離模式下，為提高4種農(nóng)藥的電噴霧離子化效率，采取向水相中加入少量甲酸和乙酸銨。

表2 4種農(nóng)藥的UPLC-MS/MS質(zhì)譜分析參數(shù)

采取質(zhì)譜進(jìn)樣，在ESI+模式下，手動(dòng)優(yōu)化毛細(xì)管電壓，錐孔電壓等，結(jié)合不同流動(dòng)相體系對(duì)4種農(nóng)藥進(jìn)行了全掃描，分析目標(biāo)物響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合儀器“Intellistart”功能快速優(yōu)化出的質(zhì)譜分析參數(shù)(表2)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，阿維菌素的準(zhǔn)分子離子主要以[M+Na]+形式出現(xiàn)，可能是因?yàn)槠浞肿咏Y(jié)構(gòu)中的醚鍵及羰基上的氧易與Na+結(jié)合，整個(gè)流路體系中極少的Na+都會(huì)與之結(jié)合形成[M+Na]+峰[5]，其余3種農(nóng)藥[M+H]+離子峰響應(yīng)信號(hào)較強(qiáng)，將其作為母離子，每種農(nóng)藥篩選出2個(gè)響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)且沒有干擾的子離子，并選用響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)的分子離子對(duì)作為定量離子對(duì)。

采用色譜進(jìn)樣，為提高目標(biāo)物分離效果和改善峰形，在0.1%甲酸-水溶液中加入乙酸銨緩沖液，考察其濃度在1～10mmol/L范圍變化對(duì)目標(biāo)物的影響。當(dāng)乙酸銨濃度太低時(shí)，不能有效調(diào)整峰形，太高了又會(huì)抑制目標(biāo)物的電離，降低靈敏度。當(dāng)加入5mmol/L乙酸銨時(shí)，改善峰形和提高靈敏度的效果最好，優(yōu)選后的流動(dòng)相色譜條件(表1)，4種農(nóng)藥的試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖(圖1)。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜檢測(cè)條件下，采用甲醇-乙腈-水體系，目標(biāo)物均在10min內(nèi)出峰，加入少量甲酸和乙酸銨后，目標(biāo)物都有較強(qiáng)的分子離子峰強(qiáng)度，峰形對(duì)稱，有效提高了檢測(cè)方法的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性。

圖1 4種農(nóng)藥的試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖(0.050mg/L)

2.2 提取劑選擇 草莓中有糖類、色素、維生素、有機(jī)酸及大量水分，為更充分地提取待測(cè)藥物，試驗(yàn)選用能與水互溶的乙腈和甲醇為提取劑。經(jīng)多次試驗(yàn)嘗試發(fā)現(xiàn)，甲醇的提取效果雖不錯(cuò)， 但沒有有效的方法能夠分離草莓中的大量水分，而乙腈對(duì)不同極性農(nóng)藥均有較好的提取效果， 對(duì)試樣中油脂和色素類雜質(zhì)的溶解度較小，利用鹽析法又能與水兩相分離，還可以除掉草莓樣品提取液中的糖類、有機(jī)酸物及維生素等大部分雜質(zhì)，有利于下一步凈化提取液，減弱樣品基質(zhì)干擾，降低基質(zhì)效應(yīng)影響。經(jīng)優(yōu)化后，選用10.00mL乙腈為提取劑。

2.3 QuEChERS 凈化方法的選擇 QuEChERS主要以N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳(GCB)和十八烷基鍵合硅膠(C18)等填料為固相吸附劑，固相填料的組成及含量是決定樣品凈化效果的主要因素。PSA有比氨基柱更強(qiáng)的離子交換能力，可與金屬離子產(chǎn)生螯合作用，廣泛用于植物農(nóng)殘分析，去除脂肪酸、有機(jī)酸、極性色素和金屬離子等。GCB主要用于吸附除去樣品提取液的大量色素，同時(shí)也會(huì)對(duì)提取液中類似于平面型結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥分子有吸附，導(dǎo)致回收率大幅降低。C18主要用于除去脂肪類等非極性化合物。因草莓樣品中脂肪含量極少，本實(shí)驗(yàn)未選用C18填料，直接選用PSA及PSA+GCB組合的兩種凈化管。選取空白草莓(紅顏)為基質(zhì)，添加農(nóng)藥含量為0.050mg/kg，乙腈提取后離心，吸取5mL上清液，加入以900mg MgSO4+150mg PSA和885mg MgSO4+150mg PSA+1mg GCB為固相分散劑的15mL凈化離心管，渦旋振蕩2min，離心后過(guò)濾膜上機(jī)，計(jì)算分析加標(biāo)回收率來(lái)考察凈化效果，結(jié)果(圖2)。

圖2 不同凈化填料對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

結(jié)果表明：僅用PSA凈化提取液時(shí)，4種農(nóng)藥的回收率均接近100%，回收率很好。用PSA+GCB凈化后，阿維菌素的回收率降低為76.9%，這是因?yàn)榘⒕S菌素是一種含有十六元大環(huán)的內(nèi)酯化合物，易被GCB填料吸附導(dǎo)致。另外，在前處理過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng) PSA 凈化后的提取液已經(jīng)變?yōu)闊o(wú)色，因此不需要再加入GCB去除色素。綜合考慮，用900mg MgSO4+150mg PSA填料凈化管處理樣品，草莓基質(zhì)空白及基質(zhì)標(biāo)液MRM色譜圖(圖3)和(圖4)，凈化后的基質(zhì)空白不干擾試樣中的目標(biāo)物測(cè)定，目標(biāo)物響應(yīng)良好，峰形對(duì)稱且無(wú)雜質(zhì)，滿足定性定量分析要求。

圖3 草莓空白基質(zhì)MRM色譜圖

圖4 4種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖(0.050mg/L)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響 基質(zhì)效應(yīng)(微乳劑)是液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法檢測(cè)中普遍存在的現(xiàn)象，指樣品中目標(biāo)分析物的濃度或者質(zhì)量檢測(cè)受一種或多種不被檢測(cè)成分影響的現(xiàn)象，可能是因?yàn)殡妵婌F離子化效率易受樣品基質(zhì)或色譜分離中的共流出物影響了待測(cè)成分的離子化效率，從而導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)信號(hào)的改變，產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)[13]。用乙腈試劑和不同空白草莓基質(zhì)溶液配制相同濃度的農(nóng)藥溶液，采用色譜進(jìn)樣來(lái)獲得目標(biāo)物的定量離子色譜峰面積，以試劑標(biāo)的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算基質(zhì)標(biāo)中農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)的相對(duì)強(qiáng)度，結(jié)果(圖5)。4種農(nóng)藥在不同草莓樣品間的微乳劑值在0.98～1.12，基質(zhì)效應(yīng)略微增強(qiáng)，不同草莓空白基質(zhì)間的差異很小，可忽略不計(jì)。為使定量結(jié)果更準(zhǔn)確，采用了反相高效液相色譜法洗脫分離目標(biāo)化合物，減少共流出物，降低了基質(zhì)干擾，同時(shí)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償。

圖5 4種農(nóng)藥在草莓基質(zhì)中的微乳劑

2.5 方法的線性范圍和檢出限 用空白草莓基質(zhì)溶液配制4種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以每種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度(x， mg/L)為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳細(xì)結(jié)果(表3)，線性相關(guān)系數(shù)r均>0.998 6。用Masslynx V4.1軟件計(jì)算信噪比(S/N)，并以S/N=3計(jì)算得到了方法的檢出限為1.2～2.0μg/kg。

表3 4種農(nóng)藥的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.6 方法的回收率、精密度與定量限 以空白草莓樣品為基質(zhì)，添加0.010、0.050、0.10mg/kg 3個(gè)濃度水平混標(biāo)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定 6次，做樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)。為模擬實(shí)樣檢測(cè)過(guò)程，稱樣后加入4種農(nóng)藥混標(biāo)，渦旋1min，密封過(guò)夜，待樣品充分吸收農(nóng)藥后，次日按照1.3～1.6節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理及上機(jī)檢測(cè)，數(shù)據(jù)結(jié)果(表4)。4種農(nóng)藥的定量限均為0.010mg/kg，平均添加回收率為85.2%～108.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.8%～5.9%，回收率和精密度符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求[14]。

表4 草莓樣品添加回收率和精密度(n=6)

續(xù)表

2.7 實(shí)樣檢測(cè) 按本方法對(duì)40個(gè)草莓樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，每個(gè)樣品做平行雙樣，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)農(nóng)藥的檢出率僅為5%，共有2批草莓中檢出含有目標(biāo)農(nóng)藥，分別為阿維菌素和噻嗪酮，但都沒有超過(guò)國(guó)內(nèi)外最大允許殘留限量值[15]。

3 結(jié)論

建立了QuEChERS 前處理方法結(jié)合 UPLC-MS/MS 檢測(cè)草莓中噻螨酮、唑螨酯、噻嗪酮、阿維菌素等4種農(nóng)藥殘留的方法。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，前處理過(guò)程簡(jiǎn)便快速、穩(wěn)定性好、靈敏度高，回收率和精密度等指標(biāo)均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，適用于草莓中該4種農(nóng)藥的同時(shí)快速測(cè)定。