李宏偉，張 揚(yáng)，鄭 斐，賈云鶴，周 飛，倪玨萍

(上海曉明檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201612)

小麥赤霉病是影響小麥生產(chǎn)的主要病害之一，在世界范圍內(nèi)分布廣泛，流行頻率高。小麥赤霉病的發(fā)生流行，不僅導(dǎo)致小麥結(jié)實(shí)率和千粒重下降，影響小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，同時(shí)病原菌在感病籽粒中產(chǎn)生的真菌毒素，尤其是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，被誤食后會(huì)引起發(fā)熱、嘔吐、腹瀉等中毒反應(yīng)，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡[1]。Li等[2]對(duì)采集于江蘇和安徽等地的59個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在89.3%小麥樣品中存在DON毒素；王淞等[3]對(duì)山東、河北、吉林等10個(gè)地區(qū)的50份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，DON檢出率為30%；Fang等[4]連續(xù)5年調(diào)查了江蘇省小麥的毒素污染水平，發(fā)現(xiàn)DON常年檢出率為50%～100%。由此可見，解決小麥赤霉病菌毒素污染問題已迫在眉睫，而控制赤霉病的發(fā)生發(fā)展是治理毒素污染問題的根源。

目前，生產(chǎn)上種植的小麥品種對(duì)赤霉病的抗性普遍較差，化學(xué)防治仍然是防控小麥赤霉病的重要手段[5]。當(dāng)前生產(chǎn)中防控小麥赤霉病的藥劑主要有苯并咪唑類(多菌靈、甲基硫菌靈等)、甾醇生物合成抑制劑類(戊唑醇、咪鮮胺、己唑醇、丙硫菌唑、葉菌唑等)和氰基丙烯酸酯類(氰烯菌酯)等3類。近年來，又有琥珀酸脫氫酶抑制劑類(氟唑菌酰羥胺)殺菌劑上市。截止2021年5月，我國登記用于防治小麥赤霉病的藥劑有413個(gè)(包括單劑與混劑)，其中，以多菌靈為有效成分的藥劑187個(gè)，以戊唑醇為有效成分的藥劑92個(gè)，以甲基硫菌靈為有效成分的藥劑81個(gè)，其次為咪鮮胺(55個(gè))、三唑酮(42個(gè))、福美雙(35個(gè))。與防治其他病害的藥劑相比，用于防治小麥赤霉病的藥劑依舊顯得不足?；诖?，本文選擇丙硫菌唑等5種不同結(jié)構(gòu)類型的殺菌劑開展了其對(duì)小麥赤霉病的室內(nèi)生測(cè)和田間小區(qū)藥效比對(duì)試驗(yàn)，旨在通過小麥赤霉病新藥篩選試驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法的建立，為研發(fā)出有效防治小麥赤霉病的新殺菌劑品種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試靶標(biāo)

小麥赤霉病病原菌(Fusarium graminearum)：室內(nèi)試驗(yàn)病原菌為相同菌株，由本實(shí)驗(yàn)室于2018年在田間采集并分離保存；田間試驗(yàn)病原菌一地為自然發(fā)生，一地為人工接種。

1.2 供試藥劑

室內(nèi)試驗(yàn)：95%丙硫菌唑(prothioconazole) TC、97%戊唑醇(tebuconazole) TC、100%氰烯菌酯(phenamacril) TC、98%多菌靈(carbendazim) TC、99.5%氟唑菌酰羥胺(pydiflumetofen) TC，由上海曉明檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

田間小區(qū)試驗(yàn)：480 g/L丙硫菌唑SC (南通泰禾化工股份有限公司)；430 g/L戊唑醇SC (拜耳作物科學(xué)有限公司)；200 g/L氟唑菌酰羥胺SC (瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)；25%氰烯菌酯SC (江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司)；50%多菌靈WP (江蘇三山農(nóng)藥有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌絲生長抑制法

參照NY/T 1156.2—2006[6]。將5種供試原藥用溶劑溶解為10 000 mg/L的母液，然后按照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果配制系列梯度濃度的試驗(yàn)藥液，并制作成直徑9 cm的含藥PDA平板，每處理3次重復(fù)。氟唑菌酰羥胺的濃度為：0.4、0.1、0.04、0.01、0.004 mg/L；其他4種藥劑的濃度為：4、1、0.4、0.1、0.04 mg/L。待含藥PDA平板晾干后，用接種針將直徑5 mm的小麥赤霉病菌餅接種至含藥平板中央，菌絲面朝下，放置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待對(duì)照菌落直徑為6～7 cm時(shí)，采用十字交叉法，調(diào)查各處理的菌落直徑，按照1.3.6節(jié)中公式(1)計(jì)算菌絲生長抑制率，用DPS v16.05統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)藥劑濃度和菌絲生長抑制率進(jìn)行數(shù)量反應(yīng)生測(cè)幾率值分析，得到各藥劑的EC75及其95%置信限。

1.3.2 葉片法

1%水瓊脂試管準(zhǔn)備：用250 mL三角瓶，稱量1.5 g瓊脂粉后，加入150 mL水，配制成1%水瓊脂(質(zhì)量/體積比)，121 ℃滅菌20 min；滅菌完成后，用移液器取3 mL 1%水瓊脂分裝至20 mL玻璃試管中，于試管架上垂直放置，冷卻待用。

接菌：將提前培養(yǎng)2～3 d的赤霉病菌，沿菌落邊緣用1.1 cm的打孔器打菌餅，后用接種器將菌餅接種至1%水瓊脂試管中，菌絲面朝上，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)18～20 h。

浸藥及培養(yǎng)：剪取一葉一心期小麥葉片，保持葉片高度在7 cm左右，每處理24片葉，將葉片浸入裝有藥液的離心管中后開始計(jì)時(shí)，20 s后將葉片取出，放置于寫好標(biāo)簽的紙巾上，晾干1 h左右，將晾干藥液的葉片分裝至寫好標(biāo)簽的 1%水瓊脂試管中，每試管中8片葉，每處理3次重復(fù)，置于人工氣候箱(25℃，12 hL/12 hD)中培養(yǎng)6 d，測(cè)量菌絲生長高度，按照1.3.6節(jié)中公式(2)計(jì)算菌絲生長抑制率。用DPS v16.05統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)藥劑濃度和菌絲生長抑制率進(jìn)行數(shù)量反應(yīng)生測(cè)幾率值分析，得到各藥劑的EC75及其95%置信限。

1.3.3 孢子萌發(fā)抑制法

參照陳雨等[7]試驗(yàn)方法。將小麥赤霉病病原菌在3%綠豆湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)5 d (28 ℃，黑暗，180 r/min)。在無菌條件下，用滅菌紗布濾去菌絲，將濾液離心(5 000 r/min，10 min)去除上清液。將分生孢子重新懸浮于滅菌水中，調(diào)節(jié)孢子濃度至1×106個(gè)/mL，制備成孢子懸浮液。取0.05 mL孢子懸浮液，涂布于含藥的1%水瓊脂(WA)平板上，每處理3次重復(fù)。涂布孢子后的平板，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃，黑暗)。24 h后調(diào)查孢子萌發(fā)情況，并按照1.3.6節(jié)中公式(3)計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

1.3.4 盆栽法

在室內(nèi)用大盆缽種植小麥至抽穗，在小麥揚(yáng)花初期，噴施配制好的藥液至麥穗上。每盆缽20穗，每處理3次重復(fù)。24 h后接種1×105個(gè)/mL的小麥赤霉病菌孢子懸浮液，置于保濕間內(nèi)培養(yǎng)(25 ℃，12 hL/12 hD，RH＞90%)，5 d后調(diào)查麥穗的病級(jí)，調(diào)查方法參照行標(biāo)NY/T 1464.15—2007[8]，并按照1.3.6中公式(5)、(6)計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

1.3.5 田間小區(qū)藥效試驗(yàn)

使用5種殺菌劑的田間推薦用量，比較其對(duì)小麥赤霉病的防效差異。

施藥2次，即小麥揚(yáng)花初期首次施藥，間隔6～7 d進(jìn)行第2次施藥；小區(qū)面積為24 m2，每處理3次重復(fù)。用水量為450 L/hm2。

2021年進(jìn)行2點(diǎn)田間試驗(yàn)。

試驗(yàn)點(diǎn)1：安徽省桐城市范崗鎮(zhèn)，赤霉病自然發(fā)生。小麥品種為揚(yáng)麥23，2020年10月20日撒播。2021年4月4日第1次施藥，間隔6 d第2次施藥，最后1次施藥后27 d進(jìn)行調(diào)查。

試驗(yàn)點(diǎn)2：江蘇省句容市后白鎮(zhèn)，首次施藥當(dāng)天，人工噴霧接種赤霉病菌孢子液。小麥品種為鄭麥9741，2020年11月20日撒播。2021年4月16日第1次施藥，間隔7 d第2次施藥，第2次施藥后24 d進(jìn)行調(diào)查。

每小區(qū)對(duì)角線5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)調(diào)查50穗。調(diào)查后計(jì)算各處理的病穗率、病情指數(shù)及防治效果。調(diào)查及計(jì)算方法參照行標(biāo)NY/T 1464.15—2007[8]。

1.3.6 計(jì)算方法和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

菌絲生長速率法：

葉片法：

孢子萌發(fā)法：

田間小區(qū)試驗(yàn)：用DPS v16.05統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)各處理的防效進(jìn)行鄧肯氏新復(fù)極差法差異顯著性分析。計(jì)算公式如下：

式中：CK1為空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù)；PT1為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長速率法

結(jié)果表明(表 1)，5種殺菌劑對(duì)小麥赤霉病的EC75為0.168 8～3.793 8 mg/L，其中氟唑菌酰羥胺對(duì)小麥赤霉病病原菌的菌絲生長抑制率最強(qiáng)，再依次是氰烯菌酯、多菌靈、戊唑醇、丙硫菌唑。該結(jié)果與谷春艷等[9]的研究結(jié)果一致。

2.2 葉片法

結(jié)果表明(表1)，5種殺菌劑對(duì)小麥赤霉病EC75為 2.5098～111.9229 mg/L，氟唑菌酰羥胺的菌絲生長抑制率最強(qiáng)，其次為丙硫菌唑、氰烯菌酯、戊唑醇和多菌靈。

表1 5種殺菌劑對(duì)小麥赤霉病菌菌絲生長的抑制活性

2.3 孢子萌發(fā)法

結(jié)果表明(表2和表3)，氟唑菌酰羥胺對(duì)小麥赤霉菌孢子的抑制活性最高，在2.5 mg/L劑量下，孢子萌發(fā)抑制率達(dá) 100%；其次為丙硫菌唑和氰烯菌酯，在 400 mg/L劑量下，孢子萌發(fā)抑制率可達(dá)到100%；戊唑醇和多菌靈對(duì)孢子的抑制活性一般，在400 mg/L劑量下，孢子萌發(fā)抑制率＜30%。這與向禮波等[10]研究結(jié)果基本一致，即氟唑菌酰羥胺對(duì)湖北省6個(gè)地區(qū)的 106株禾谷鐮孢菌孢子的平均 EC50為(0.176 0± 0.059 6) mg/L，且氟唑菌酰羥胺的活性顯著高于氰烯菌酯。

表2 2種殺菌劑對(duì)小麥赤霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

表3 3種殺菌劑對(duì)小麥赤霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2.4 盆栽法

結(jié)果表明(表4)，在相同施藥濃度下，氟唑菌酰羥胺對(duì)小麥赤霉病的防治效果最好，其次為丙硫菌唑、氰烯菌酯、戊唑醇和多菌靈。

表4 5種殺菌劑對(duì)盆栽小麥赤霉病的活性

2.5 田間小區(qū)藥效試驗(yàn)

兩地試驗(yàn)結(jié)果表明(表5)，5種殺菌劑在江蘇試驗(yàn)點(diǎn)的防效均低于安徽試驗(yàn)點(diǎn)的防效。分析其原因，安徽試驗(yàn)點(diǎn)為自然發(fā)病，發(fā)病較輕，清水對(duì)照的病指為 8.19；而江蘇試驗(yàn)點(diǎn)在自然發(fā)病的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了人工接種，發(fā)病較重，清水對(duì)照的病指為29.79。但 5種殺菌劑在兩地所表現(xiàn)出的防效高低趨勢(shì)一致。其中，480 g/L丙硫菌唑SC和200 g/L氟唑菌酰羥胺 SC對(duì)小麥赤霉病的防效最高，其防效可穩(wěn)定在85%以上；其次為430 g/L戊唑醇SC和25%氰烯菌酯SC，其防效可穩(wěn)定在75%以上；50%多菌靈WP的防效最低，但仍能達(dá)到70%以上。

表5 5種殺菌劑對(duì)小麥赤霉病的田間防治效果

2.6 方法的綜合評(píng)價(jià)

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，在5種試驗(yàn)方法下，氟唑菌酰羥胺、戊唑醇、氰烯菌酯、多菌靈和丙硫菌唑均對(duì)小麥赤霉病表現(xiàn)出較好的活性，但同種藥劑在不同試驗(yàn)方法下，表現(xiàn)出的活性有所不同。以氰烯菌酯和丙硫菌唑?yàn)槔?，?在菌絲生長速率法和葉片法下，氰烯菌酯的EC75分別為0.833 7、18.538 1 mg/L；丙硫菌唑的EC75分別為3.793 8、15.376 5 mg/L，同樣是抑制菌絲生長，氰烯菌酯在離體和半活體條件下的活性相差22倍；丙硫菌唑在離體和半活體條件下的活性相差4倍。⑵ 在孢子萌發(fā)抑制法和盆栽法下，在劑量100 mg/L時(shí)，氰烯菌酯的孢子萌發(fā)抑制率為6.81%，而盆栽法的防效為58.4%；丙硫菌唑的孢子萌發(fā)抑制率為 3.88%，而盆栽法的防效為70.4%，同樣是抑制孢子活性，兩種方法下的活性差異顯著。⑶ 田間小區(qū)試驗(yàn)中，氰烯菌酯的施用劑量為750 g ai/hm2(折算到劑量為1 000 mg/L)，防效達(dá)77.61%～91.74%。以達(dá)到75%防效計(jì)，室內(nèi)(葉片法)和田間劑量的相關(guān)倍數(shù)約54倍；丙硫菌唑的施用劑量為200 g ai/hm2(折算到劑量為267 mg/L)，防效達(dá)89.50%～93.89%。以達(dá)到75%防效計(jì)，室內(nèi)(葉片法)和田間劑量的相關(guān)倍數(shù)約18倍。

3 討 論

在新藥研發(fā)過程中，采用何種生物測(cè)定方法，能夠快速、準(zhǔn)確地篩選出有效的化合物，已成為極為重要的研究內(nèi)容。本文結(jié)合在新化合物篩選中的實(shí)際工作，對(duì)5種生測(cè)方法進(jìn)行了系統(tǒng)比較，見表6。

表6 5種不同試驗(yàn)方法的差異比較

菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法是離體測(cè)試，優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)周期短，重復(fù)性好，用藥量少，能夠定性測(cè)定出與化合物直接作用的活性。缺點(diǎn)是單獨(dú)使用一種方法，不能同時(shí)測(cè)定對(duì)菌絲和孢子的活性。該兩種方法適用于新化合物普篩階段的快速篩選，便于先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化。

葉片法優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)材料易得，浸葉片后的藥液可用于其他靶標(biāo)的活體盆栽篩選，有利于節(jié)省化合物的用量；該方法是藥劑通過與葉片互作后發(fā)揮作用，更接近于藥劑在田間實(shí)際應(yīng)用的情況。但該方法主要測(cè)定藥劑對(duì)菌絲的抑制活性，無法同時(shí)測(cè)定藥劑對(duì)孢子的抑制活性，因此存在一定的局限性。該方法適用于對(duì)活性化合物的驗(yàn)證。

盆栽法是一種模擬病原菌田間侵染過程的測(cè)定方法，其優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性好，與田間試驗(yàn)的相關(guān)性高；其不足之處在于該方法所需化合物的量多，且小麥從播種到抽穗的生長周期長，接種孢子后對(duì)培養(yǎng)條件的要求較高。該方法適用于活性化合物進(jìn)入田間前的活性驗(yàn)證。

田間小區(qū)試驗(yàn)?zāi)軌驕?zhǔn)確評(píng)價(jià)高活性化合物的真實(shí)防效，但該試驗(yàn)方法所需的化合物量多，且試驗(yàn)開展受季節(jié)限制。為提高試驗(yàn)的成功率，建議在齊穗期到揚(yáng)花初期進(jìn)行人工接種，增大菌源量，同時(shí)選擇便于澆水的田塊，提高田間濕度，促進(jìn)病害發(fā)生。另外，各地的小麥赤霉病病原菌的敏感性可能不同，因此，在進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)時(shí)可選擇多地同時(shí)進(jìn)行。該方法適用于高活性化合物的田間藥效驗(yàn)證及評(píng)價(jià)。

綜上所述，建議菌絲生長速率法、孢子萌發(fā)法用于先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化，葉片法、盆栽法用于活性化合物的驗(yàn)證，田間小區(qū)試驗(yàn)用于高活性化合物的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。該方法在本試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的應(yīng)用已篩選到部分高殺菌活性化合物，并進(jìn)行了田間驗(yàn)證，證明該方法可適用于小麥赤霉病新殺菌劑的篩選與評(píng)價(jià)。