申少華， 劉迎娣， 王子愷， 李春濤， 李 聞

1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100853； 2.北京市順義區(qū)醫(yī)院消化內(nèi)科

梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ)，也稱梗黃，在臨床上較多見(jiàn)，很多疾病均可引起梗黃。膽道梗阻后，因腸道失去膽汁，腸道菌群失調(diào)，腸黏膜屏障遭到破壞，易發(fā)生腸源性細(xì)菌異位，進(jìn)而引起全身感染。并且此時(shí)肝臟Kupffer細(xì)胞的免疫功能受到抑制，清除內(nèi)毒素的能力下降[1]。以上這些因素最終導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的形成。

我們的研究屬于梗黃系列基礎(chǔ)研究。目前解除膽道梗阻有膽汁內(nèi)引流術(shù)和膽汁外引流術(shù)兩種方法。我們之前的研究表明，膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于外引流術(shù)主要在于膽汁酸可促進(jìn)細(xì)胞免疫功能恢復(fù)[1]。多數(shù)學(xué)者的研究表明，膽汁內(nèi)引流術(shù)效果優(yōu)于外引流[2]。但膽汁內(nèi)引流術(shù)解除梗黃優(yōu)于外引流術(shù)的機(jī)制尚不十分清楚。膽汁內(nèi)引流術(shù)與外引流術(shù)的根本區(qū)別在于膽汁是否重新進(jìn)入腸道，膽汁酸在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中扮演重要角色[3-4]，膽汁酸通過(guò)其受體分子信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用越來(lái)越受到關(guān)注和重視。

Gadaleta等[5]研究發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥可能通過(guò)病原識(shí)別受體通路下游轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的作用，抑制FXR激活和表達(dá)；FXR和NF-κB之間在腸道水平存在交互調(diào)節(jié)。

病原模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)天然免疫及誘導(dǎo)獲得性免疫中也起到重要作用，其中TLR4是Toll樣受體家族(Toll like receptors，TLRs)最早被發(fā)現(xiàn)的，并且近些年被大量研究，在迅速識(shí)別和對(duì)抗外界致病性病原微生物引發(fā)的免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色[6]。本研究就梗黃、內(nèi)外引流術(shù)后和激動(dòng)劑處理后回腸黏膜TLR4和FXR受體表達(dá)的變化，初步探討膽汁酸受體與PRRs家族之間的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為指導(dǎo)臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體質(zhì)量25～35 g的健康雄性昆明小鼠100只購(gòu)自維通利華科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng)，進(jìn)食水不受限制，普通動(dòng)物飼料飼養(yǎng)。用恰當(dāng)型號(hào)灌胃針進(jìn)行灌胃。收集標(biāo)本時(shí)所有動(dòng)物均為過(guò)量乙醚麻醉。本研究得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2016-x11-01)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立：將昆明小鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為四組：梗黃組(OJ組)、膽汁外引流組(ED組)、膽汁內(nèi)引流組(ID組)和假手術(shù)組(SH組)，每組15只。另外40只小鼠用同樣方法分成四組，每組10只。每組再均分為激動(dòng)劑組：FXR激動(dòng)劑GW4064(美國(guó)Abmole Bioscience公司)和對(duì)照組：0.5%羧甲基纖維素鈉CMC-Na(美國(guó)Sigma公司)，每組各5只，OJ組、SH組分別在第1次手術(shù)前1 d開(kāi)始灌胃，ID組和ED組分別在引流術(shù)前1 d開(kāi)始灌胃，均至取標(biāo)本當(dāng)天結(jié)束，其他手術(shù)處理及標(biāo)本制備同第一部分。所有手術(shù)過(guò)程均采用98%氧氣和28%異氟烷吸入性麻醉。動(dòng)物模型的建立均是在顯微鏡下完成。這個(gè)模型和我們之前課題組李聞等建立的梗黃內(nèi)外引流大鼠模型[7]是一脈相承的，部分細(xì)節(jié)因?yàn)樾∈篌w型小而進(jìn)行了改良(見(jiàn)圖1)。

注：A:分離膽管;B:SH組;C:OJ組;D～E:ED組;F:ID組。

1.2.2 標(biāo)本制備：SH組和OJ組在手術(shù)后第9天處死小鼠并采集標(biāo)本，ID組和ED組在行引流術(shù)后第9天處死小鼠并采集標(biāo)本。小鼠于取材前禁食12 h，以乙醚持續(xù)麻醉。固定小鼠于手術(shù)板，備皮后常規(guī)消毒鋪巾。距回腸末端分別取2 cm、5 cm和5 cm回腸組織，其中2 cm回腸組織置入10%中性福爾馬林溶液固定至少24 h，兩份5 cm回腸組織用外科剪沿縱軸剪開(kāi)，然后用無(wú)菌的載玻片刮取腸黏膜組織，分別置入已標(biāo)記好的無(wú)菌無(wú)RNA酶的凍存管中。迅速放入液氮后，盡快轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存待用。回腸離體后應(yīng)在10 min內(nèi)完成標(biāo)本制備。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)：(1)SH組、OJ組稱取手術(shù)前后小鼠的體質(zhì)量；ID組、ED組稱取二次手術(shù)前后的體質(zhì)量，計(jì)算前后體質(zhì)量差值。(2)肝功檢測(cè)：于取標(biāo)本日用1 ml注射器心臟取血，離心取上層血清約0.5 ml用來(lái)檢測(cè)肝功：ALT、TBIL、DBIL、ALP。多功能酶標(biāo)儀連續(xù)檢測(cè)即可計(jì)算出各個(gè)值。(3)病理學(xué)檢測(cè)：HE染色病理學(xué)觀察分析：將制成的肝組織蠟塊切成約4 μm厚度的切片，進(jìn)行HE染色，光鏡觀察并顯微照相，最終比較四組小鼠回腸黏膜炎癥情況。(4)蛋白質(zhì)印跡分析(Western blotting)：使用RIPA裂解液及PMSF提取總的蛋白，取各組20 μg混合總蛋白以10% SDS-PAGE凝膠電泳分離。電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉封閉過(guò)夜，分別加入FXR(1∶2 000，Abcam，ab129089)、TLR4(1∶1 000，Abcam，ab22048)和β-actin一抗(1∶2 000，Abcam，ab8227)于封閉袋中4 ℃孵育過(guò)夜；二抗室溫孵育1 h。最后在凝膠成像系統(tǒng)顯影中得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算比較目標(biāo)蛋白表達(dá)量。(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)：用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen，cat. No: 18080-051)，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物設(shè)計(jì)來(lái)自北京賽百盛公司，Actin引物序列上游引物：5′-CAGAAGGAGATTACTGCTCTGGCT-3′，下游引物：5′-GGAGCCACCGATCCACACA-3′；FXR引物序列上游引物：5′-CGGCGGAGATTTTCAATAAG-3′，下游引物：5′-GAAACTGAACATCGGGGTTAT-3′；TLR4引物序列上游引物：5′-TTCAGAACTTCAGTGGCTGG-3′，下游引物：5′-TGTTAGTCCAGAGAAACTTCCTG-3′。Roche 480型熒光定量PCR儀(瑞士Roche)，25 μl反應(yīng)體系熒光染料法，95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min此步驟收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完成后同在60～95 ℃進(jìn)行融解曲線分析，每10 s升高1 ℃。內(nèi)參和目的片段分別同批擴(kuò)增，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量及一般情況SH組小鼠皮膚、飲食、活動(dòng)量及尿、便正常，體質(zhì)量增加明顯，與OJ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與ED組、ID組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OJ組小鼠皮膚發(fā)黃，毛發(fā)粗亂無(wú)光澤，尿色深黃，大便干結(jié)、量少，呈現(xiàn)便秘狀態(tài)，結(jié)腸內(nèi)糞塊零星分布，飲食、活動(dòng)量減少，體質(zhì)量略增加，與ID組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與ED組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膽汁引流術(shù)后小鼠一般狀態(tài)均好轉(zhuǎn)。與其他三組比較，ED組小鼠體質(zhì)量明顯下降。ID組與OJ組比較，實(shí)驗(yàn)小鼠基本狀態(tài)改善，體質(zhì)量略增加(見(jiàn)表1)。

表1 各組小鼠手術(shù)前、后體質(zhì)量及二者差值結(jié)果Tab 1 Pre- and post-surgery weights and the differences between them in each group

2.2 肝功能梗黃小鼠肝功能變得很差。小鼠膽道梗阻后，肝功能指標(biāo)ALT、TBIL、DBIL和ALP較SH組明顯升高，行膽汁內(nèi)外引流術(shù)后，ID和ED組小鼠上述各項(xiàng)肝功能指標(biāo)顯著改善，與SH組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

表2 各組小鼠手術(shù)后肝功結(jié)果Tab 2 Liver function result in each group after surgery

2.3 回腸組織病理學(xué)SH組和ID組回腸黏膜組織基本正常。膽道梗阻后，可見(jiàn)輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)。ED組小鼠回腸黏膜炎癥情況與OJ組類似(見(jiàn)圖2)。

圖2 四組小鼠回腸腸組織HE染色結(jié)果Fig 2 Histopathology of the terminal ileum (HE staining) in 4 groups of mice

2.4 回腸黏膜TLR4和FXR受體表達(dá)

2.4.1 四組小鼠腸黏膜FXR及TLR4蛋白及mRNA的表達(dá)水平：Western blotting方法檢測(cè)腸黏膜FXR和TLR4蛋白的表達(dá)水平。小鼠膽道梗阻后，腸黏膜FXR表達(dá)較SH組明顯升高(P<0.001)；膽汁外引流術(shù)后，F(xiàn)XR表達(dá)較稍有下降(P=0.001)，仍高于SH組水平(P<0.001)；然而膽汁內(nèi)引流術(shù)后，F(xiàn)XR表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.001)，但尚未降到SH組水平(P=0.002)，效果好于外引流(P<0.001)(見(jiàn)圖3)。小鼠膽道梗阻后，腸黏膜TLR4表達(dá)較SH組明顯降低(P<0.001)；膽汁外引流術(shù)后，表達(dá)稍有增強(qiáng)(P=0.018)，但仍低于SH組水平(P<0.001)；膽汁內(nèi)引流術(shù)后，TLR4表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.001)，但尚未升到SH組水平(P=0.007)，效果好于外引流(P=0.006)(見(jiàn)圖4)。

圖3 四組腸黏膜組織FXR蛋白表達(dá)比較Fig 3 Comparison of FXR protein expression in ileal mucosa in the 4 groups

圖4 四組腸黏膜組織TLR4蛋白表達(dá)比較Fig 4 Comparison of TLR4 protein expression in the ileal mucosa in the 4 groups

qRT-PCR法檢測(cè)四組小鼠腸黏膜FXR和TLR4 mRNA的表達(dá)水平。小鼠膽道梗阻后，腸黏膜FXR mRNA水平較SH組明顯升高(P<0.001)；膽汁外引流術(shù)后，F(xiàn)XR mRNA水平稍有上升(P=0.519)，仍高于SH組水平(P<0.001)；然而，膽汁內(nèi)引流術(shù)后，F(xiàn)XR mRNA水平明顯下調(diào)(P=0.066)，但尚未降到SH組水平(P=0.008)，效果好于外引流(P=0.023)(見(jiàn)圖5)。小鼠膽道梗阻后，腸黏膜TLR4 mRNA較SH組明顯降低(P<0.001)；膽汁外引流后，表達(dá)稍有增強(qiáng)(P=0.021)，仍低于SH組水平(P<0.001)；膽汁內(nèi)引流術(shù)后，TLR4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.001)，但尚未升到SH組水平(P=0.002)，效果好于外引流(P<0.001)(見(jiàn)圖6)。

圖5 四組腸黏膜FXR mRNA表達(dá)比較; 圖6 四組腸黏膜TLR4 mRNA表達(dá)比較Fig 5 Comparison of FXR mRNA expression in the ileal mucosa in the 4 groups; Fig 6 Comparison of TLR4 mRNA expression in the ileal mucosa in the 4 groups

2.4.2 CMC-Na和GW4064處理小鼠后腸黏膜TLR4蛋白及mRNA表達(dá)結(jié)果：Western blotting方法檢測(cè)腸黏膜TLR4蛋白的表達(dá)水平。對(duì)照組：小鼠膽道梗阻后，腸黏膜TLR4表達(dá)較SH組顯著降低(P<0.001)；膽汁外引流術(shù)后，表達(dá)稍有提高(P=0.083)，仍低于SH組水平(P<0.001)；膽汁內(nèi)引流術(shù)后，TLR4表達(dá)明顯升高(P=0.002)，但尚未升到SH組水平(P=0.014)，效果好于外引流(P=0.027)(見(jiàn)圖7)。激動(dòng)劑組：OJ組、ED組、ID組、SH組腸黏膜TLR4表達(dá)四組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖8)。激動(dòng)劑組中OJ組的TLR4蛋白表達(dá)與對(duì)照組中OJ組的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.736)，而激動(dòng)劑組中SH組的TLR4蛋白表達(dá)與對(duì)照組中SH組的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)(見(jiàn)圖9)。

圖7 對(duì)照組中四組腸黏膜組織TLR4蛋白表達(dá)比較Fig 7 Comparison of TLR4 protein expression in the ileal mucosa in the 4 groups of the vehicle group

圖8 激動(dòng)劑組中四組腸黏膜組織TLR4蛋白表達(dá)比較Fig 8 Comparison of TLR4 protein expression in the ileal mucosa in the 4 groups of the GW4064 group

圖9 分別比較OJ組和SH組中對(duì)照組和激動(dòng)劑組的腸黏膜TLR4蛋白水平Fig 9 Comparison of TLR4 protein expression levels in the ileal mucosa in the vehicle and GW4064 groups of the OJ and SH groups

qRT-PCR檢測(cè)腸黏膜TLR4 mRNA的表達(dá)水平。對(duì)照組：小鼠膽道梗阻后，腸黏膜TLR4 mRNA表達(dá)較SH組明顯降低(P=0.034)；膽汁外引流術(shù)后，TLR4 mRNA表達(dá)水平稍有上升(P=0.822)，仍低于SH組水平(P=0.049)；膽汁內(nèi)引流后，TLR4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P=0.127)，但尚未升到SH組水平(P=0.480)(見(jiàn)圖10)。激動(dòng)劑組：OJ組、ED組、ID組、SH組腸黏膜TLR4 mRNA表達(dá)在四組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖11)。激動(dòng)劑組中OJ組的TLR4 mRNA表達(dá)與對(duì)照組中OJ組的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.736)，而激動(dòng)劑組中SH組的TLR4 mRNA表達(dá)與對(duì)照組中SH組的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043)(見(jiàn)圖12)。

3 討論

由于小鼠具有膽囊，與人類的生理結(jié)構(gòu)和功能相對(duì)更接近，并且小鼠敲基因的技術(shù)相對(duì)于大鼠更成熟，因此，使用小鼠可以為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。目前利用小鼠梗黃模型來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的報(bào)道少見(jiàn)，而我們成功地建立了小鼠梗黃及膽汁內(nèi)外引流的模型。這個(gè)模型和我們課題組之前建立的大鼠梗黃模型[7]是一脈相承的，部分細(xì)節(jié)因小鼠體型小而進(jìn)行了相應(yīng)的改良，優(yōu)點(diǎn)包括二次引流術(shù)時(shí)粘連較輕、術(shù)中出血量少、術(shù)后引流管不易堵塞和可以長(zhǎng)期存活以供研究。這個(gè)模型的成功建立可以通過(guò)膽汁內(nèi)外引流術(shù)后肝功能的全面恢復(fù)和腸道炎癥緩解證明。我們主要研究了膽汁內(nèi)外引流術(shù)對(duì)OJ小鼠腸道中FXR與TLR4表達(dá)的影響，并通過(guò)FXR激動(dòng)劑灌胃治療探討FXR和TLR4之間可能的調(diào)控機(jī)制。

因FXR可識(shí)別和結(jié)合生理水平的膽汁酸，F(xiàn)XR也因此被稱為膽汁酸受體。FXR在肝臟、腎臟、腎上腺和小腸組織中高表達(dá)[8]，在回腸中FXR mRNA含量最高[9]。FXR調(diào)節(jié)體內(nèi)膽汁酸的水平，同時(shí)參與機(jī)體內(nèi)脂代謝和糖代謝，并起著重要的調(diào)節(jié)作用[9-10]。FXR也可以保護(hù)腸黏膜，OJ時(shí)，F(xiàn)XR可通過(guò)反饋性調(diào)節(jié)膽汁酸代謝來(lái)發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞并抑制腸道細(xì)菌增殖、移位等重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠膽道梗阻后，OJ組小鼠較SH組小鼠FXR水平明顯升高，可能原因是膽道梗阻后，膽汁酸的腸肝循環(huán)被中斷，膽汁酸無(wú)法流入腸道，所以膽汁酸配體FXR表達(dá)水平反饋性升高，以促進(jìn)膽汁酸代謝，從而保護(hù)腸黏膜。梗黃小鼠進(jìn)行外引流術(shù)后，膽汁引流到體外，膽汁同樣無(wú)法流入腸道，F(xiàn)XR受體表達(dá)也反饋性地略升高；梗黃小鼠進(jìn)行內(nèi)引流術(shù)后，膽汁酸從膽腸吻合口重新流入腸道，F(xiàn)XR受體也稍升高，但是更和SH組接近。FXR蛋白表達(dá)水平和mRNA水平在OJ組、ED組、ID組、SH組大體上逐漸遞減。

機(jī)體固有免疫細(xì)胞可通過(guò)病原PRRs直接識(shí)別微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)并與之結(jié)合，進(jìn)而被激活并啟動(dòng)機(jī)體免疫防御反應(yīng)。PRRs包括TLRs和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體家族(nucleotide binding oligomerzation domains，NODs)。TLR4可通過(guò)啟動(dòng)天然免疫調(diào)節(jié)獲得性免疫，在一系列免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，所以在研究中我們檢測(cè)TLR4表達(dá)水平。在人體內(nèi)TLR4主要表達(dá)于天然免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞)和非免疫細(xì)胞(如腸上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腎臟系膜細(xì)胞)上[11]。TLR4可以識(shí)別多種內(nèi)源性和外源性配體，外源性配體主要涉及內(nèi)毒素，包括革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[12]。TLR4是天然免疫系統(tǒng)中的Ⅰ型跨膜受體[13]，可非特異性地與PAMPs結(jié)合，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致核因子NF-κB激活，引發(fā)多種炎癥介質(zhì)表達(dá)，因而TLR4可通過(guò)啟動(dòng)天然免疫調(diào)節(jié)獲得性免疫，在一系列免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠膽道梗阻后，TLR4表達(dá)水平均較SH組明顯下降，并且表達(dá)水平在OJ組、ED組、ID組和SH組中逐漸升高，四組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，梗黃后腸黏膜TLR4表達(dá)水平下降，考慮可能原因是，梗黃初期手術(shù)后LPS刺激TLR4反應(yīng)性升高[14]，隨著梗黃時(shí)間延長(zhǎng)，腸源性細(xì)菌移位造成“腸源性膿毒癥”進(jìn)而引起內(nèi)毒素耐受，最終導(dǎo)致TLR4水平下降。所謂內(nèi)毒素耐受即在體外或體內(nèi)，第一次受LPS刺激后，如果不久再次受到LPS沖擊，機(jī)體免疫應(yīng)答會(huì)明顯減弱[15]。

Gadaleta等[5]分別從細(xì)胞、組織和動(dòng)物水平分別給予炎癥刺激(TNF-α/IL-1β)和NF-κB的亞單位p50或p65處理，均發(fā)現(xiàn)腸道FXR活性降低，下游基因表達(dá)下降。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR也可以抑制炎癥[16-18]，二者相互抑制，進(jìn)而可能導(dǎo)致惡性循環(huán)，降低的FXR活性對(duì)炎癥抑制作用減弱，進(jìn)而形成慢性腸道炎癥。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠梗黃后回腸末段黏膜FXR表達(dá)水平反饋性升高，但既往文獻(xiàn)[19]表明，梗黃后FXR活性降低，其靶基因IBABP和FGF15/19等表達(dá)明顯降低，進(jìn)而對(duì)腸道炎癥抑制作用減弱，腸道促炎癥因子活化的NF-κB信號(hào)通路可能會(huì)增強(qiáng)，但由于上述多種原因可能造成腸黏膜固有免疫功能受到抑制，進(jìn)而TLR4介導(dǎo)的LPS活化NF-κB信號(hào)通路中的TLR4表達(dá)受到抑制，TLR4表達(dá)水平下降。我們的推測(cè)在文章另一部分通過(guò)分別用FXR激動(dòng)劑和安慰劑處理四組小鼠后回腸黏膜TLR4表達(dá)的情況得到了證明。

四組小鼠給予CMC-Na灌胃后TLR4表達(dá)水平趨勢(shì)和上述無(wú)任何處理的小鼠基本保持一致。小鼠給予GW4064灌胃后，四組之間TLR4表達(dá)差異消失，可能原因是四組小鼠腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，腸黏膜免疫屏障功能均得到了不同程度的恢復(fù)。Gadaleta等[18]證實(shí)結(jié)腸炎小鼠接受FXR的激動(dòng)劑INT-747后，腸道炎癥反應(yīng)減輕，結(jié)腸黏膜炎癥因子釋放降低，阻止了腸道通透性的增加。Inagaki等[3]研究發(fā)現(xiàn)也和我們基本一致。SH組小鼠分別給予GW4064和CMC-Na處理后，兩組之間TLR4表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GW4064組低于CMC-Na組?？赡茉?yàn)槟c道本身就不是無(wú)菌環(huán)境，TLR4維持在適度水平，給予GW4064處理后，致病菌、腸道炎癥進(jìn)一步得到抑制，進(jìn)而TLR4水平較對(duì)照組下降。OJ組小鼠分別給予GW4064和CMC-Na處理后，兩組之間TLR4表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)照組可能原因是梗黃持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)機(jī)體固有免疫水平低下，而激動(dòng)劑組可能因?yàn)槟c道炎癥受到明顯抑制而降低。

以上關(guān)于FXR與TLR4相互調(diào)節(jié)的機(jī)制的推測(cè)有待我們進(jìn)一步在細(xì)胞和組織水平驗(yàn)證，需要進(jìn)一步利用基因敲除小鼠和野生小鼠來(lái)對(duì)比觀察，并且觀察在不同時(shí)間點(diǎn)FXR、TLR4及其下游基因表達(dá)的變化，以進(jìn)一步明確FXR和TLR4二者之間具體的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膽汁內(nèi)引流效果好于外引流。主要不同在于膽汁內(nèi)引流術(shù)可以使腸道膽汁復(fù)現(xiàn)，膽汁酸可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增生，恢復(fù)緊密連接結(jié)構(gòu)正?；?，進(jìn)而恢復(fù)腸道屏障功能。膽汁酸還抑制有害細(xì)菌生長(zhǎng)，降低內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，腸道固有免疫功能也適當(dāng)恢復(fù)，進(jìn)而TLR4表達(dá)基本恢復(fù)至對(duì)照組水平。內(nèi)引流術(shù)后使腸道恢復(fù)膽汁，而外引流術(shù)后膽汁大量丟失，膽汁上述保護(hù)機(jī)制均缺失，甚至引起水電解質(zhì)紊亂和酸堿失衡。另外，膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于膽汁外引流術(shù)也表現(xiàn)在小鼠體質(zhì)量術(shù)前、術(shù)后的差值上，外引流術(shù)后小鼠體質(zhì)量明顯降低，與其他三組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其主要原因是上述機(jī)制，其他原因?yàn)橥庖餍g(shù)創(chuàng)傷確實(shí)較大。我們從小鼠回腸末段HE染色結(jié)果也可以看出內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于外引流術(shù)，表現(xiàn)為內(nèi)引流組腸道炎癥較外引流組略輕。

多項(xiàng)研究[2,20]發(fā)現(xiàn)，膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于膽汁外引流術(shù)，我們與這些研究主要的不同在于我們證明膽汁酸通過(guò)調(diào)節(jié)FXR和TLR4在腸上皮細(xì)胞的表達(dá)來(lái)改善腸道功能。

小鼠梗黃形成后，腸道FXR升高，TLR4下降，膽汁內(nèi)引流和外引流均可逆轉(zhuǎn)這些改變，但內(nèi)引流效果優(yōu)于外引流。FXR激動(dòng)劑通過(guò)活化FXR間接調(diào)控TLR4，從而保護(hù)腸黏膜。腸道內(nèi)膽汁酸是解釋這些現(xiàn)象的關(guān)鍵。

總之，膽汁內(nèi)引流術(shù)效果優(yōu)于外引流術(shù)的機(jī)制部分可能與腸黏膜組織FXR、TLR4受體的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，具體機(jī)制仍待進(jìn)一步深入研究。