李 昕， 段一夢(mèng)， 張美英， 郭明洲

1．鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科醫(yī)學(xué)部

胰腺癌是最致命的癌癥之一，死亡率極高。盡管其他腫瘤患者的存活率有了一定的提高，但自20世紀(jì)60年代以來，胰腺癌患者的存活率一直保持相對(duì)不變[1-2]。目前手術(shù)切除是其唯一的治愈機(jī)會(huì)。不幸的是，80%～85%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)切除機(jī)會(huì)。此外，胰腺癌對(duì)大多數(shù)化療及分子靶向治療反應(yīng)不佳[3]。隨著人口的老齡化，胰腺癌的發(fā)病呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，50歲以后發(fā)病率開始增加，70歲達(dá)到高峰。5%～10%的患者具有遺傳傾向，一些具有遺傳綜合征的特征性基因突變是胰腺癌的危險(xiǎn)因素，如BRCA1/2(乳腺和卵巢癌綜合征)、ATM(共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥)、STK11(Peutz-Jeghers綜合征)、PRSS1(遺傳性胰腺炎)、MLH1和MSH2/6(Lynch綜合征)[4]。另外，飲酒和吸煙也是胰腺癌的危險(xiǎn)因素[5]。胰腺癌主要分為兩型：胰腺腺癌占95%，胰腺內(nèi)分泌腫瘤約占5%(<5%)[6]。由于胰腺癌早期缺乏典型的癥狀，其早期診斷仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。對(duì)進(jìn)展期胰腺癌FOLFIRINOX方案[5-fluorouracil、Folinic acid (Leucovorin)、Irinotecan、Oxaliplatin]和吉西他濱(Gemcitabine)結(jié)合白蛋白紫杉醇(Nab-paclitaxel)是目前的主要治療手段[7]。盡管免疫治療在其他腫瘤中獲得了一定的效果，但在胰腺癌中的療效非常有限[8]。由于許多信號(hào)通路參與細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控，且這些通路之間存在復(fù)雜的交叉互通現(xiàn)象(crosstalking)，針對(duì)單一異常通路的靶向治療常常效果不佳。另外，由于胰腺癌的高度異質(zhì)性也決定了針對(duì)單一通路的治療效果有限[4，9-11]，因此，需要深入研究胰腺癌的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而獲得高效、特異的“協(xié)同致死”治療靶標(biāo)。近年來，隨著人們對(duì)表觀遺傳認(rèn)識(shí)的深入，以表觀遺傳為基礎(chǔ)的“協(xié)同致死”取得了一些新的進(jìn)展[11-17]。在胰腺癌中分離和鑒定新的表觀遺傳異常的標(biāo)志物將會(huì)提供更多新的治療策略。

環(huán)指蛋白180(ring finger protein 180,RNF180)是一種新發(fā)現(xiàn)的環(huán)指蛋白家族的成員，該基因位于人類染色體5q12.3，該區(qū)域在許多腫瘤中均發(fā)生缺失[18-19]。在胃癌和肝癌中頻繁發(fā)生甲基化，RNF180甲基化與幽門螺桿菌感染和胃癌的預(yù)后差相關(guān)[20-23]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，RNF180具有E3泛素連接酶活性，其通過下調(diào)RAD51增加三陰性乳腺癌對(duì)吉非替尼的敏感性[24]。RNF180在胰腺癌中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌細(xì)胞系及組織標(biāo)本本實(shí)驗(yàn)涉及9個(gè)胰腺癌細(xì)胞系(CFPAC1、Panc5.04、PANC1、T3M4、MIAPaCa2、SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1)均是已建立的原發(fā)性胰腺癌患者的細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI 1640包含1%青霉素-鏈霉素，10%胎牛血清。細(xì)胞均在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2和溫度為37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。1∶3進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)12 h后，向培養(yǎng)基中加入5-aza-dc使其終濃度為2 μmol/L，每24 h更換新的含有2 μmol/L 5-aza-dc的RPMI 1640培養(yǎng)基，藥物處理96 h后，提取細(xì)胞總RNA。本實(shí)驗(yàn)采用的112例胰腺癌組織和8例非癌患者的正常胰腺組織均來自中國人民解放軍總醫(yī)院。取材的所有患者術(shù)前均未接受任何放化療等治療，術(shù)后病理檢查均證實(shí)為原發(fā)性胰腺癌。本研究獲得中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：20090701-015)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞總RNA提取與半定量RT-PCR檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，提取總RNA后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和質(zhì)量。取5 μg總RNA用Thermo Scientific RevertAid RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA溶液，作為后續(xù)PCR反應(yīng)的模版cDNA，用去離子水稀釋至100 μl，取2.5 μl的cDNA模板在25 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RNF180 RT-PCR引物序列為：5′-CTCCGGGACGTGGATACAGAT-3′(上游引物)，5′-GGGCTTTTTGGATTAGGCAGC-3′(下游引物)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為254 bp。RNF180 RT-PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3個(gè)循環(huán))；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3個(gè)循環(huán))；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(3個(gè)循環(huán))；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(26個(gè)循環(huán))；72 ℃ 7 min。GAPDH RT-PCR引物序列為：5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(上游引物)，5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(下游引物)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為454 bp。GAPDH RT-PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(25個(gè)循環(huán))；72 ℃ 7 min。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 DNA的提取、甲基化特異性PCR(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞采用酚/氯仿法抽提DNA，最后溶于ddH2O。取2 μg DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉硫化后，采用DNA純化試劑盒純化，最后溶于20 μl的ddH2O，-20 ℃冰箱保存[25-26]。RNF180啟動(dòng)子區(qū)特異性甲基化PCR引物序列為：5′-TCGGGGTTGTTAGGTATAGTTCGAGC-3′(甲基化上游引物)，5′-AACTCTAAAAACTCGCTACGACTCCG-3′(甲基化下游引物)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為111 bp。RNF180啟動(dòng)子區(qū)特異性非甲基化PCR引物序列為：5′-GGTTGGGGTTGTAGGTATAGTTTGAGT-3′(非甲基化上游引物)，5′-CAAACTCTAAAAACTCACTACAACTCCA-3′(非甲基化下游引物)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為115 bp。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))；72 ℃ 7 min。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用χ2檢驗(yàn)分析RNF180甲基化率與胰腺癌患病相關(guān)因素的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNF180在胰腺癌中的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的調(diào)控在胰腺癌細(xì)胞CFPAC1、Panc5.04和PANC1細(xì)胞中RNF180基因高表達(dá)，在MIAPaCa2和T3M4細(xì)胞中表達(dá)降低，而在SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1細(xì)胞中表達(dá)缺失。MSP結(jié)果顯示，RNF180基因啟動(dòng)子區(qū)在CFPAC1、Panc5.04和PANC1細(xì)胞中呈非甲基化狀態(tài)，在MIAPaCa2和T3M4細(xì)胞中部分甲基化，在SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1細(xì)胞中完全甲基化。這些結(jié)果表明，RNF180基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化與其表達(dá)水平密切相關(guān)。然后，應(yīng)用去甲基化藥物5-aza-dc處理胰腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RNF180在非甲基化的細(xì)胞(CFPAC1、Panc5.04和PANC1)中表達(dá)水平無明顯改變，部分甲基化細(xì)胞(MIAPaCa2和T3M4)其表達(dá)水平增加，完全甲基化細(xì)胞(SW1990、Panc10.05、PANC3.11和AsPC1)恢復(fù)其表達(dá)(見圖1)。以上結(jié)果表明，RNF180基因的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控。

注：ddH2O：體系陰性對(duì)照；GAPDH：內(nèi)參對(duì)照；(-)：5-aza-dc處理前；(+)：5-aza-dc處理后。NL：正常淋巴細(xì)胞DNA，非甲基化對(duì)照組；IVD：體外甲基化DNA，甲基化對(duì)照組；H2O：體系陰性對(duì)照；U：非甲基化；M：甲基化。

2.2 RNF180在胰腺癌組織中頻繁發(fā)生甲基化為探討RNF180基因在原發(fā)性胰腺癌中的甲基化情況，應(yīng)用MSP方法檢測(cè)了112例原發(fā)性胰腺癌及8例非癌患者正常胰腺組織。RNF180基因在非癌患者正常胰腺標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)甲基化，排除了組織特異性甲基化的可能性。在112例原發(fā)性胰腺癌組織中，35例發(fā)生甲基化，77例未發(fā)生甲基化，甲基化率為31.25%(35/112，見圖2)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，RNF180甲基化與胰腺癌的TNM分期有相關(guān)性(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、吸煙、飲酒等因素?zé)o相關(guān)性(P均>0.05，見表1)。

注：M：甲基化，U：非甲基化，PN：正常胰腺組織，PC：胰腺癌組織。

表1 RNF180甲基化與原發(fā)性胰腺癌臨床因素的關(guān)系Tab 1 The association of RNF180 methylation with clinical factor in primary pancreatic cancer

3 討論

RNF180在胃癌和肝癌頻繁發(fā)生甲基化，且在結(jié)腸癌、胃癌和乳腺癌中影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[21，23-24，27-28]。RNF180在胃癌中通過E3泛素化酶的作用發(fā)揮翻譯后調(diào)控，從而影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，是胃癌預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)后因素[28]。在三陰性乳腺癌中，RNF180通過下調(diào)RAD51降低對(duì)吉非替尼的敏感性[24]。我們?cè)谝认侔┲邪l(fā)現(xiàn)，RNF180頻繁發(fā)生甲基化，且其表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控。RNF180甲基化與腫瘤的分期相關(guān)，而與其他臨床因素之間的關(guān)系差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些結(jié)果表明RNF180甲基化可能是食管癌預(yù)后不良的因素。樣本量相對(duì)較小是本研究的局限性。我們擬在未來的研究中擴(kuò)大樣本量并增加癌前病變病例進(jìn)一步分析。因?yàn)镽NF180參與RAD51的調(diào)控，我們擬在未來的研究中探討RNF180是否參與DNA損傷修復(fù)機(jī)制。最終明確RNF180能否成為胰腺癌早期診斷的標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

RNF180基因在人類胰腺癌頻繁發(fā)生甲基化，其表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)域甲基化調(diào)控。RNF180甲基化是胰腺癌潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。