王楷， 侯雨君， 廖晨希， 譚玉， 王路， 陳穎， 周思遠(yuǎn)

· 實(shí)驗(yàn)技術(shù) ·

大鼠腹膜源肥大細(xì)胞外泌體的分離、培養(yǎng)與鑒定*

王楷， 侯雨君， 廖晨希， 譚玉， 王路， 陳穎， 周思遠(yuǎn)△

（成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院/第三附屬醫(yī)院，四川 成都 610075）

分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠腹膜源肥大細(xì)胞外泌體。提取8～10周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠腹腔灌洗液，使用Percoll密度梯度分離法分離灌洗液中的肥大細(xì)胞，通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色鑒定肥大細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入白細(xì)胞介素3和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)肥大細(xì)胞成熟，收集細(xì)胞上清液，采用超速離心法分離上清液中的外泌體，通過(guò)透射電鏡，納米流式細(xì)胞儀從外泌體形態(tài)、粒徑和表面標(biāo)志蛋白三個(gè)方面鑒定外泌體。分離得到的肥大細(xì)胞被甲苯胺藍(lán)染成藍(lán)紫色，分離的肥大細(xì)胞外泌體呈典型盤(pán)狀，粒徑分布范圍為30～150 nm，平均粒徑為75.33 nm，外泌體表面標(biāo)志蛋白CD9和CD81呈陽(yáng)性表達(dá)。Percoll密度梯度分離法聯(lián)合超速離心法分離大鼠腹腔灌洗液中肥大細(xì)胞外泌體的方法是可行的。

肥大細(xì)胞；外泌體；超速離心

肥大細(xì)胞（mast cells， MCs）由骨髓中的CD34+/CD117+前體細(xì)胞分化而來(lái)，隨血液循環(huán)遷移至外周組織中。MCs主要分布在皮膚、胃腸道和呼吸道等與外界環(huán)境直接接觸的部位。MCs屬于先天免疫細(xì)胞，同時(shí)參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫，其表型和功能受周圍環(huán)境和生長(zhǎng)因子的影響［1］，受到外界刺激時(shí)能分泌預(yù)先合成的組胺、蛋白酶及從頭合成的細(xì)胞因子和趨化因子等，介導(dǎo)炎癥、免疫和傷害性感覺(jué)等生理病理反應(yīng)，同時(shí)也能分泌外泌體（exosomes）等微小囊泡。

外泌體是由細(xì)胞分泌的磷脂雙分子膜包繞的胞外囊泡，直徑約30～150 nm［2］。幾乎所有細(xì)胞在生理及病理狀態(tài)下均可釋放和攝取外泌體。外泌體囊狀結(jié)構(gòu)內(nèi)攜帶的微小RNAs（microRNAs， miRNAs）、信使RNAs（messenger RNAs， mRNAs）、蛋白質(zhì)以及其降解片段，是細(xì)胞間以及細(xì)胞與鄰近微環(huán)境之間傳遞信息的載體［3］。穩(wěn)定的生物學(xué)特性以及可以攜帶生物信息的特點(diǎn)，使其既具有作為早期診斷依據(jù)的潛力，又有望成為治療的靶點(diǎn)。

肥大細(xì)胞也能分泌外泌體，已有研究對(duì)骨髓源肥大細(xì)胞外泌體［4］和腹腔肥大細(xì)胞［5］的提取方法進(jìn)行報(bào)道，這為相關(guān)疾病生理病理的深入研究提供了重要基礎(chǔ)。腹腔灌洗液的細(xì)胞學(xué)檢查已經(jīng)在臨床中廣泛應(yīng)用，是研究腹腔相關(guān)臟器病變機(jī)制的重要手段。目前尚無(wú)研究報(bào)道腹膜源肥大細(xì)胞外泌體的提取方法，本課題綜合現(xiàn)有肥大細(xì)胞和外泌體的提取方法，通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，摸索出一種高效可行的大鼠腹膜源肥大細(xì)胞外泌體提取方法，以期為相關(guān)研究者提供參考。

材料和方法

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠［8～10周齡，（220±20） g，10只］，購(gòu)自成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK（川）2020-030，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物房，使用許可證編號(hào)SYXK（川）2019-049，自由飲食，溫度（22±2） ℃，濕度50%，晝夜12 h/12 h，所有操作均獲得成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理備案號(hào)為2021-15。

2　主要試劑與儀器

D-Hanks溶液購(gòu)自Solarbio；Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)自Biosharp；NaCl購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化工有限公司；無(wú)外泌體血清購(gòu)自TransGen Biotech；超純水（優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：型號(hào)UPH-II-10T）；異氟烷購(gòu)自RWD；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；甲苯胺藍(lán)染液購(gòu)自Sigma；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自HyClone；干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（stem cell growth factor， SCF）重組蛋白購(gòu)自Genscript；白細(xì)胞介素3（interleukin-3， IL-3）重組蛋白購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司；PBS購(gòu)自Sangon Biotech； FITC Mouse IgG購(gòu)自BioLegend；FITC Mouse Anti-Human CD9和FITC Mouse Anti-Human CD81購(gòu)自BD；青、鏈霉素混合液購(gòu)自Gibco。

0.45 μm過(guò)濾膜購(gòu)自Millipore；HT-7700型透射電鏡和CP100MX型超速離心機(jī)購(gòu)自Hitachi；納米流式細(xì)胞儀購(gòu)自NanoFCM（型號(hào)N30E）。

3　方法

3.1大鼠腹腔灌洗液收集使用異氟烷與氧氣的混合氣體麻醉大鼠，將大鼠固定于無(wú)菌泡沫板上，并且將麻醉機(jī)調(diào)至維持劑量面罩維持麻醉，使用紗布蘸取75%乙醇對(duì)大鼠的腹部進(jìn)行消毒，使用無(wú)菌手術(shù)剪剪開(kāi)腹壁劍突至肚臍的上皮，充分暴露腹部肌肉層，用無(wú)菌齒鑷提起腹中部暴露的肌肉層，注射器抽取10 mL D-Hanks溶液注射入腹腔內(nèi)。如圖1所示，雙手輕輕振蕩按摩腹部?jī)蓚?cè)，持續(xù)1 min，再用齒鑷提起腹部肌肉層，用手術(shù)剪剪開(kāi)一個(gè)小口，使用10 mL無(wú)菌注射器從腹腔內(nèi)吸取6 mL以上的灌洗液，注入無(wú)菌帶蓋的15 mL離心管內(nèi)，在4 ℃冰箱中臨時(shí)貯存，大鼠脫頸處死。

Figure 1.　Intraperitoneal injection of D-Hanks solution. After inhalation of 3% isoflurane with nasal mask to maintain anesthesia， the rats were intraperitoneally injected with 10 mL D-Hanks solution， and the abdomen was massaged for 1 min.

3.2腹膜源肥大細(xì)胞分離及上清液收集稱取0.85 g NaCl與10 mL超純水充分混合，得到濃度為8.5%的NaCl溶液，再將8.5%的NaCl溶液溶液10倍稀釋為0.85% NaCl溶液；預(yù)先配制具有生理性滲透壓的100% Percoll原液：按照9體積Percoll分離液與1體積的8.5％ NaCl溶液進(jìn)行充分混合；再用0.85％ NaCl溶液稀釋成75%和70%的Percoll分離液；取2 mL的75% Percoll分離液和2 mL的70% Percoll分離液分別依次沿離心管壁加入；將腹腔灌洗液樣品于225×離心5 min，棄去上清，加入1 mL PBS重懸；將分離得到的細(xì)胞懸液沿管壁緩慢加入上述Percoll分離液中；然后放入離心機(jī)中，501×離心20 min；吸取位于75%和70% Percoll分離液之間的呈乳白色的細(xì)胞于1.5 mL EP管中，300×離心5 min，棄上清，吸取500 μL紅細(xì)胞裂解液（過(guò)濾除菌）于EP管中，重懸細(xì)胞，靜置約3 min后，306×離心5 min，棄去上清，以去除紅細(xì)胞；加入1 mL PBS于EP管中，通過(guò)無(wú)菌移液器反復(fù)吹打混勻以洗滌細(xì)胞；將20 μL甲苯胺藍(lán)染液加入20 μL細(xì)胞懸液，充分混勻染色2 min，鑒定肥大細(xì)胞；剩余的細(xì)胞懸液306×離心5 min，棄上清，加入1 mL由血清和DMSO按體積9∶1配制的凍存液，移液器吹打混勻后使用凍存管存放于-80 ℃冰箱。取肥大細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，添加含10%無(wú)外泌體血清、10 μg/L IL-3和20 μg/L SCF的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度約90%時(shí)，收集細(xì)胞上清（共收集約50 mL），使用4 ℃、2 000×離心10 min，目的是去除細(xì)胞碎片用于提取外泌體。

3.3肥大細(xì)胞上清液外泌體分離將上述收集的細(xì)胞上清液放入37 ℃水浴鍋中速融，然后將樣品移至一個(gè)新的離心管內(nèi)4 ℃、2 000 ×離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，4 ℃、10 000×再次離心45 min，該步驟是為了去掉較大的細(xì)胞外囊泡；取上清，使用過(guò)濾膜（孔徑0.45 μm）進(jìn)行過(guò)濾，回收濾液；將過(guò)濾后的液體裝入新的離心管中，改用超速離心機(jī)，4 ℃、100 000×離心70 min，去除上清；用10 mL預(yù)冷的1×PBS洗滌后，4 ℃、100 000×再次離心70 min；去除上清，再次用100 μL預(yù)冷的1×PBS重懸即為所要提取的外泌體。取10 μL外泌體用于外泌體形態(tài)觀察，10 μL用于外泌體粒徑檢測(cè)，20 μL用于外泌體表面標(biāo)志蛋白分析，剩余的外泌體置于-80 ℃冰箱保存。

4　外泌體鑒定

4.1外泌體形態(tài)觀察使用Hitachi透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。使用移液器吸取上述提取的外泌體樣品10 μL小心滴入電鏡銅網(wǎng)，經(jīng)過(guò)1 min沉淀后，使用濾紙輕輕吸去銅網(wǎng)邊緣的液體，再向銅網(wǎng)內(nèi)滴加10 μL醋酸雙氧鈾，同樣沉淀1 min，吸干銅網(wǎng)邊緣多余的浮液，在室溫下自然風(fēng)干數(shù)分鐘，選擇100 kV進(jìn)行電鏡拍照，獲得外泌體形態(tài)檢測(cè)結(jié)果。

4.2外泌體粒徑分析使用NanoFCM納米流式檢測(cè)儀分析外泌體粒徑。將外泌體樣品取出10 μL稀釋到30 μL，檢測(cè)前按照說(shuō)明書(shū)先用標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試儀器性能，外泌體樣品上機(jī)必須在儀器檢測(cè)合格后方可進(jìn)行，注意上樣需根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行梯度稀釋，以免造成進(jìn)樣針堵塞，待自動(dòng)檢測(cè)完成后即可獲得外泌體的粒徑和濃度檢測(cè)結(jié)果。

4.3外泌體表面標(biāo)志蛋白檢測(cè)使用納米流式檢測(cè)儀評(píng)估外泌體表面標(biāo)志蛋白濃度。將20 μL外泌體稀釋至90 μL，取30 μL稀釋外泌體分別與20 μL熒光標(biāo)記的CD9、CD81和IgG抗體混合均勻，在無(wú)光環(huán)境中37 ℃孵育30 min，加入1 mL預(yù)冷的PBS，選擇超速轉(zhuǎn)子，4 ℃、110 000×超速離心70 min，小心去除上清，加入1 mL預(yù)冷的PBS，選擇超速轉(zhuǎn)子，再次4 ℃、110 000×超速離心70 min，小心去除上清，用50 μL預(yù)冷的1×PBS重懸，同樣需提前用標(biāo)準(zhǔn)品校正儀器，測(cè)試合格后方可上樣，注意需進(jìn)行梯度稀釋以免造成進(jìn)樣針堵塞，待樣本完成檢測(cè)即可獲得儀器檢測(cè)蛋白指標(biāo)結(jié)果。

結(jié)果

1　大鼠腹膜源肥大細(xì)胞分離染色鑒定結(jié)果

使用Percoll密度梯度分離到的腹膜源肥大細(xì)胞呈白色云霧狀，如圖2所示。經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色的肥大細(xì)胞呈藍(lán)紫色，形態(tài)多呈圓形、橢圓形，如圖3所示。復(fù)蘇肥大細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)14 d后，如圖4所示，可見(jiàn)細(xì)胞布滿細(xì)胞培養(yǎng)板。

Figure 2.　Mast cells were isolated by Percoll density gradient separation.

Figure 3.　Mast cells isolated were identified by toluidine blue staining.

Figure 4.　Post-recovery mast cell culture for 14 d. Mast cells covered almost the entire cell culture plate.

2　外泌體鑒定結(jié)果

透射電鏡下觀察到外泌體呈邊緣厚，中心薄的圓盤(pán)狀，大小不一，邊界清稀，結(jié)構(gòu)完整，如圖5A所示。外泌體的直徑分布主要位于30～150 nm之間，平均粒徑為75.33 nm，如圖5B所示。外泌體表面表達(dá)標(biāo)志蛋白CD9和CD81表達(dá)陽(yáng)性，而同型對(duì)照IgG為陰性，如圖5C所示。

Figure 5.　Identification of exosomes secreted by peritoneal mast cells. A： the exosomes observed under transmission electron microscope； B： particle size distribution was detected by nano-flow cytometry （NanoFCM）； C： exosome-specific markers CD81 and CD9 were determined by NanoFCM. Red particles represent positivity.

討論

本研究描述了一種成年SD大鼠的腹膜源肥大細(xì)胞外泌體提取方案，結(jié)果表明應(yīng)用Percoll密度梯度分離法分離SPF級(jí)大鼠腹腔灌洗液中的肥大細(xì)胞聯(lián)合超速離心法分離肥大細(xì)胞上清液中外泌體的方法是可行的。所獲得的肥大細(xì)胞外泌體表現(xiàn)出典型特征，如杯盤(pán)狀，表面標(biāo)志蛋白CD9和CD81陽(yáng)性等。大量文獻(xiàn)多是研究對(duì)皮膚源［6］、骨髓源和腹膜源［7］肥大細(xì)胞的分離培養(yǎng)，或是對(duì)血液、尿液［8］和永生細(xì)胞［9］等外泌體進(jìn)行提取，但是關(guān)于腹膜源肥大細(xì)胞分泌的外泌體研究甚少。本研究利用Percoll密度梯度離心，并采用細(xì)胞生長(zhǎng)因子IL-3和SCF聯(lián)合培養(yǎng)得到純度較高的原代腹膜來(lái)源的肥大細(xì)胞，對(duì)收集的細(xì)胞上清液使用超速離心法分離外泌體，為后續(xù)研究肥大細(xì)胞外泌體在疾病中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

Percoll是一種硅膠顆?；鞈乙?，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，可根據(jù)肥大細(xì)胞的密度（1.09～1.17）×103g/L調(diào)節(jié)分離液密度［10］，既能保護(hù)細(xì)胞生物活性又可提取到高純度細(xì)胞。值得注意的是，在本實(shí)驗(yàn)提取過(guò)程中關(guān)鍵的步驟是吸取腹腔灌洗液時(shí)，要盡可能避免樣本的血液污染并盡量吸入最大量的灌洗液，這對(duì)于獲得大量高純度的腹膜源肥大細(xì)胞至關(guān)重要。

外泌體的分離方法主要包含超速離心、體積排阻色譜法、過(guò)濾法、免疫分離、隔離篩選法及密度梯度離心等，其中超速離心法是外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)。研究證實(shí)超速離心法分離外泌體純度高、回收率高，同時(shí)最大限度減少蛋白質(zhì)聚集體和其他膜粒子的共純化，有利于保護(hù)外泌體的功能，這對(duì)后續(xù)進(jìn)行外泌體相關(guān)的研究至關(guān)重要。對(duì)提取到的外泌體鑒定方法一般從三個(gè)方面進(jìn)行，即外泌體形態(tài)觀察、粒徑分析和標(biāo)志蛋白檢測(cè)。NanoFCM是從單顆粒水平檢測(cè)粒徑分布、濃度和熒光分析［11］。在檢測(cè)外泌體的粒徑方面，NanoFCM的分辨率較納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis， NTA）方法更高，所檢測(cè)的直徑范圍更廣，能夠覆蓋完整的外泌體粒徑范圍，這使檢測(cè)結(jié)果更精確。在檢測(cè)外泌體蛋白標(biāo)志物方面，NanoFCM與常用的Western blot相比，不僅可以從單顆粒水平對(duì)外泌體進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，還能對(duì)蛋白標(biāo)志物進(jìn)行雙熒光標(biāo)記。

綜上所述，本研究通過(guò)Percoll密度梯度分離法聯(lián)合超速離心法提取大鼠腹膜源肥大細(xì)胞外泌體，并對(duì)所提取到的外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生物學(xué)兩個(gè)方面進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究腹膜源肥大細(xì)胞外泌體相關(guān)功能奠定基礎(chǔ)。

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Isolation, culture and identification of mast cell exosomes from rat peritoneum

WANG Kai， HOU Yu-jun， LIAO Chen-xi， TAN Yu， WANG Lu， CHEN Ying， ZHOU Si-yuan△

（，，610075，）

Isolation， culture and identification of mast cell exosomes.Peritoneal lavage fluid was extracted from 8-to-10-week-old female SD rats. The mast cells were isolated by Percoll density gradient separation method. Interleukin-3 and stem cell growth factor were added to induce mast cell maturation. Mast cells were identified by toluidine blue staining. Mast cell supernatant was collected， and exosomes were separated by high-speed low-temperature centrifugation. Transmission electron microscopy， particle size analysis and flow cytometry were used to detect the shape， diameter and marker protein of exosomes， respectively.Isolated mast cells were stained blue-purple with toluidine blue. The particle size distribution range was 30 to 150 nm， the average particle size was 75.33 nm. Expression of exosomal surface marker proteins CD9 and CD81 were detected.The complete mast cell exosomes were successfully isolated from the rat abdominal cavity.

Mast cells； Exosomes； Ultracentrifugation

R33-33； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.024

1000-4718（2022）06-1148-05

2021-12-29

2022-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 82074558）

Tel： 028-87689918； E-mail： zsy@cdutcm.edu.cn

（責(zé)任編輯：宋延君，李淑媛）