孫磊， 洪楚原， 尹雪霞， 郭雄波， 張實， 鐘北平， 王國強

抑制MCL-1可逆轉(zhuǎn)敲除引起的結(jié)直腸癌細(xì)胞對司美替尼化療敏感性下降*

孫磊， 洪楚原， 尹雪霞， 郭雄波， 張實， 鐘北平， 王國強△

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510260）

明確程序性死亡配體1programmed death ligand-1，-敲除是否可引起結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）細(xì)胞對司美替尼化療敏感性下降，并探尋逆轉(zhuǎn)-敲除引起的司美替尼化療敏感性下降的方法。人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞及敲除-的RKO細(xì)胞接受司美替尼處理后，Western blot檢測兩組細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3， C-Casp-3）蛋白水平的差異，流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞集落形成實驗分別檢測兩組細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞存活率。沉默髓細(xì)胞白血病基因1（myeloid cell leukemia-1，-）或AZD5991聯(lián)合司美替尼處理后，Western blot檢測RKO及敲除-的RKO細(xì)胞中C-Casp-3蛋白水平，流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞集落形成實驗分別檢測細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞存活率。司美替尼聯(lián)合AZD5991處理小鼠結(jié)腸腺癌MC38細(xì)胞及沉默-的MC38細(xì)胞，Western blot檢測細(xì)胞中C-Casp-3蛋白水平，流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞集落形成實驗分別檢測細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞存活率。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，司美替尼可顯著降低磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase， p-ERK）蛋白水平，敲除-可顯著降低細(xì)胞中司美替尼誘導(dǎo)產(chǎn)生的C-Casp-3，而-shRNA或聯(lián)合使用AZD5991可顯著增加細(xì)胞中司美替尼誘導(dǎo)產(chǎn)生的C-Casp-3。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除-顯著降低了司美替尼誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡，而-shRNA或聯(lián)合使用AZD5991均可顯著增加司美替尼誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞集落形成結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除-顯著提高了低濃度司美替尼條件下細(xì)胞的存活率，而-shRNA或聯(lián)合使用AZD5991均可顯著降低細(xì)胞的存活率。更重要的是，-shRNA或聯(lián)合使用AZD5991均有效逆轉(zhuǎn)了-敲除引起的C-Casp-3、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞存活率的改變。敲除-可引起CRC細(xì)胞對司美替尼化療敏感性下降，沉默-基因或聯(lián)合使用AZD5991可逆轉(zhuǎn)-敲除引起的CRC細(xì)胞對司美替尼化療敏感性下降。

髓細(xì)胞白血病基因1；程序性死亡配體1；司美替尼；結(jié)直腸癌；化療敏感性

在我國，結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排第三位，且發(fā)病率逐年升高。靶向治療是CRC綜合治療的重要組成部分，然而藥物耐藥嚴(yán)重影響了患者的治療效果，成為影響患者預(yù)后的重要因素之一。因此，明確CRC化療耐藥的相關(guān)機制并探尋相應(yīng)的治療靶點，這對改善CRC患者的預(yù)后具有重要的研究意義。

腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡配體1（programmed death ligand-1， PD-L1；又稱為CD274或者B7H1）是重要的免疫檢查蛋白，可通過與T細(xì)胞表面受體程序性死亡蛋白1（programmed death-1， PD-1）特異性結(jié)合引起免疫逃逸，而阻斷PD-L1/PD-1之間的相互作用可有效抑制多個腫瘤的發(fā)展。目前針對PD-L1/PD-1的免疫治療在多個腫瘤中顯示出巨大的臨床價值，其中腫瘤組織PD-L1蛋白表達(dá)陽性被認(rèn)為是可采取抗PD-L1/PD-1治療的重要標(biāo)記物［1］。然而，在CRC中僅有約10%的患者腫瘤組織PD-L1蛋白表達(dá)陽性，絕大部分患者難以從抗PD-L1/PD-1免疫治療中獲益［2-3］。PD-L1除了發(fā)揮其免疫檢查點的功能外，其自身可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在多個腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用并參與腫瘤的化療耐藥［4］。在卵巢癌中，PD-L1可通過抑制自噬及激活mTOR信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，并在免疫正常的小鼠中發(fā)現(xiàn)沉默-可顯著抑制腫瘤的生長［5］。在黑色素瘤中，PD-L1通過mTOR信號通路促進腫瘤細(xì)胞的增殖［6］。在乳腺癌中，PD-L1可促進細(xì)胞增殖并通過JAK2/STAT3信號通路參與腫瘤的化療耐藥［7］；在胃癌中，沉默-可影響腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移［8］。以上研究結(jié)果表明PD-L1除了發(fā)揮其免疫功能外，在腫瘤的增殖、凋亡及化療耐藥中均可發(fā)揮重要的作用。因此，明確PD-L1在CRC中的非免疫功能有著重要的研究價值和臨床意義。本研究擬探討在CRC細(xì)胞中敲除-對司美替尼化療敏感性的影響，并探尋逆轉(zhuǎn)-敲除引起的司美替尼化療敏感性下降的治療方法。

材料和方法

1　細(xì)胞、主要試劑和儀器

人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞、小鼠結(jié)腸腺癌MC38細(xì)胞及敲除-的RKO和MC38細(xì)胞株均由美國梅奧診所秦波教授贈送。

慢病毒感染相關(guān)試劑購自Sigma；所有抗體均購自Cell Signaling Technology；Annexin V和PI購自Becton Dickinson；Gimasa試劑購自Sigma；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo；流式細(xì)胞儀購自Bio-Techne。

2　方法

2.1慢病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)于6 cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80% 融合時更換含有6 mg/L polybrene的1 mL新鮮培養(yǎng)基，并加入2 mL含髓細(xì)胞白血病基因1（myeloid cell leukemia-1，-） shRNA質(zhì)粒的慢病毒懸液，培養(yǎng)箱孵育12 h后，更換含嘌呤霉素（1∶5 000）的新鮮培養(yǎng)基進行篩選，待細(xì)胞數(shù)量足夠時采用Western blot測定感染效率。

2.2Western blot收集培養(yǎng)皿中的所有細(xì)胞至15 mL離心管，1 500 r/min離心5 min，棄去上清后冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入SDS裂解液裂解細(xì)胞并100 ℃煮沸20 min。樣本上樣到SDS-PAGE凝膠孔中，100 V電泳1 h，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5%牛奶室溫封閉30 min。PBST洗膜3次后加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次后加入Ⅱ抗孵育1 h，PBST洗膜3次后加顯影劑顯影曝光并掃描拍照。

2.3流式細(xì)胞術(shù)每個樣本設(shè)置3個重復(fù)孔，藥物處理48 h后，收集培養(yǎng)皿中所有細(xì)胞至15 mL離心管，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，冷的PBS洗細(xì)胞2次，100 μL 1× Binding Buffer重懸細(xì)胞，每管分別加入Annexin V和PI染色，以上操作全部在冰上完成。室溫靜置30 min后上流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。

2.4細(xì)胞集落形成實驗細(xì)胞融合度約為80%時收集細(xì)胞至15 mL離心管，用0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單個細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌后無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后使用不同藥物濃度的無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞密度稀釋至5×105/L，2 mL細(xì)胞懸液加入6孔板中，每個濃度設(shè)3個重復(fù)孔。14 d后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞后加入甲醛固定細(xì)胞5 min，吸去甲醛加入Gimsa染常溫染色30 min，自來水緩流洗去染色液，孔板干燥后計數(shù)細(xì)胞集落的數(shù)量。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件行統(tǒng)計分析。所有數(shù)值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用獨立樣本檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　敲除PD-L1降低CRC細(xì)胞對司美替尼的化療敏感性

RKO細(xì)胞及敲除-的RKO細(xì)胞經(jīng)過司美替尼的處理后，Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)司美替尼可顯著降低p-ERK蛋白水平，表明司美替尼可有效阻斷MEK/ERK信號通路，并且司美替尼可顯著抑制PD-L1蛋白的表達(dá)，這與之前的研究結(jié)果一致［9］；重要的是，敲除-可顯著降低細(xì)胞中C-Casp-3蛋白水平（圖1A）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除-可顯著降低司美替尼引起的細(xì)胞凋亡（圖1B）。細(xì)胞集落形成實驗證實，在低濃度的司美替尼培養(yǎng)基中，敲除-可顯著提高RKO細(xì)胞的存活率（圖1C）。以上結(jié)果表明，敲除-可降低CRC細(xì)胞對司美替尼的化療敏感性。

Figure 1.　Knockout of PD-L1 decreased chemosensitivity of human colon carcinoma RKO cells to selumetinib. A： Western blot results showed that selumetinib significantly decreased p-ERK protein level， and knockout of PD-L1 significantly decreased selumetinib-induced cleaved caspase-3 （C-Casp-3） protein level； B： flow cytometric results showed that knockout of PD-L1 significantly increased the apoptotic rate after selumetinib treatment； C： colony formation assay results showed that knockout of PD-L1 significantly increased the cell survival rate after selumetinib treatment. Mean±SD. n=3. **P<0.01.

2　沉默MCL-1可逆轉(zhuǎn)PD-L1敲除引起的CRC細(xì)胞對司美替尼化療敏感性下降

MCL-1可通過結(jié)合Bim蛋白抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，而司美替尼可通過激活caspase通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，我們推測沉默-可能會逆轉(zhuǎn)敲除-引起的CRC細(xì)胞對司美替尼的耐藥性。首先，在RKO及敲除-的RKO細(xì)胞中慢病毒感染沉默-，然后加入司美替尼處理細(xì)胞48 h。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默-可顯著升高兩組細(xì)胞中C-Casp-3蛋白水平，且兩組細(xì)胞之間C-Casp-3蛋白水平未見顯著差異（圖2A）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默-可顯著增加司美替尼引起的細(xì)胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)了-敲除引起的兩組細(xì)胞凋亡的差異（圖2B）。

Figure 2.　Knockdown of MCL-1 reversed PD-L1 knockout-decreased chemosensitivity of human colon carcinoma RKO cells to selumetinib. A： Western blot results showed that knockdown of MCL-1 significantly increased selumetinib-induced C-Casp-3 protein level in both RKO and PD-L1 knockout RKO cells， and no significant difference was shown in the two cell lines； B： flow cytometric results showed that knockdown of MCL-1 significantly increased the apoptosis of both RKO and PD-L1 knockout RKO cells induced by selumetinib， and no significant difference was shown in the two cell lines. n=3. **P<0.01.

3　聯(lián)合使用MCL-1抑制劑AZD5991可逆轉(zhuǎn)PD-L1敲除引起的司美替尼化療敏感性下降

AZD5991是MCL-1的特異性抑制劑，我們聯(lián)合使用AZD5991和司美替尼共處理RKO細(xì)胞48 h。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用AZD5991可顯著升高兩組細(xì)胞中C-Casp-3蛋白水平，兩組細(xì)胞之間C-Casp-3蛋白水平未見顯著差異（圖3A）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，聯(lián)合使用AZD5991可顯著增加司美替尼引起的細(xì)胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)了-敲除引起的細(xì)胞凋亡的差異（圖3B）。細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用AZD5991可顯著降低低司美替尼濃度下的細(xì)胞存活率，并逆轉(zhuǎn)了-敲除引起的細(xì)胞存活率的差異（圖3C）。

Figure 3.　Combination treatment with AZD5991 reversed PD-L1 knockout-decreased chemosensitivity of human colon carcinoma RKO cells to selumetinib. A： Western blot results showed that combination treatment with AZD5991 significantly increased selumetinib-induced cleaved caspase-3 （C-Casp-3） protein level in both RKO and PD-L1 knockout RKO cells， and no significant difference was shown in the two cell lines； B： flow cytometric results showed that combination treatment with AZD5991 significantly increased selumetinib-induced apoptosis of both RKO and PD-L1 knockout RKO cells， and no significant difference was shown in the two cell lines； C： colony formation assay results showed that combination treatment with AZD5991 significantly decreased the survival rate of both RKO and PD-L1 knockout RKO cells， and no significant difference was shown in the two cell lines. Mean±SD. n=3. **P<0.01.

為進一步證實以上研究結(jié)果，我們在小鼠結(jié)腸腺癌MC38細(xì)胞中重復(fù)上述實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默-可顯著降低細(xì)胞中C-Casp-3蛋白水平及司美替尼引起的細(xì)胞凋亡，增加了低司美替尼濃度下的細(xì)胞存活率；聯(lián)合使用AZD5991可逆轉(zhuǎn)-敲除引起的C-Casp-3、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞存活率的差異（圖4）。

Figure 4.　Combination treatment with AZD5991 reversed PD-L1 knockout-decreased chemosensitivity of mouse colon adenocarcinoma MC38 cells to selumetinib. A： Western blot results showed that combination treatment with AZD5991 significantly increased selumetinib-induced cleaved caspase-3 （C-Casp-3） protein level in both MC38 and PD-L1 knockout MC38 cells， and no significant difference was shown in the two cell lines； B： flow cytometric results showed that combination treatment with AZD5991 significantly increased selumetinib-induced apoptosis of both MC38 and PD-L1 knockout MC38 cells， and no significant difference was shown in the two cell lines； C： colony formation assay results showed that combination treatment with AZD5991 significantly decreased the survival rate of both MC38 and PD-L1 knockout MC38 cells， and no significant difference was shown in the two cell lines. Mean±SD. n=3. **P<0.01.

以上實驗結(jié)果表明，聯(lián)合AZD5991可顯著提高兩組細(xì)胞對司美替尼的化療敏感性，并逆轉(zhuǎn)了-敲除引起的細(xì)胞對司美替尼化療敏感性下降。

討論

PD-L1是重要的免疫檢查點，并且抗PD-L1/PD-1治療在部分腫瘤患者中取得令人矚目的療效，因此，PD-L1與PD-1結(jié)合后誘導(dǎo)的免疫逃逸機制成為目前的研究熱點。然而，除了免疫檢查點的功能外，PD-L1自身在腫瘤的發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要的作用。PD-L1在腫瘤細(xì)胞或者免疫細(xì)胞中的表達(dá)水平被認(rèn)為是抗PD-L1/PD-1治療有效的預(yù)測因子［10］，然而，在CRC組織中，PD-L1表達(dá)的陽性率較低［2-3］，并且部分表達(dá)陽性患者對抗PD-L1/PD-1治療無效。因此，明確PD-L1自身在腫瘤發(fā)展中的機制同樣有著重要的作用。在胰腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抑制PD-L1可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移［11］；在人頭頸部鱗癌及肺腺癌組織中發(fā)現(xiàn)，PD-L1可促進上皮間質(zhì)變，細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下降，而vimentin表達(dá)增加［12-13］。此外，PD-L1在腫瘤化療耐藥中同樣發(fā)揮重要的作用，在卵巢癌細(xì)胞中，沉默-通過抑制P-gp及細(xì)胞周期蛋白D1進而增加細(xì)胞對順鉑的化療敏感性［14］，在頭頸部鱗癌中，沉默-可顯著增加順鉑耐藥細(xì)胞的化療敏感性［15］。目前，PD-L1在CRC化療耐藥中的作用及機制的研究較少。司美替尼是MEK1/2信號通路特異性抑制劑，目前已批準(zhǔn)應(yīng)用于多個腫瘤的治療，其作用機制主要是通過抑制ERK1/2的磷酸化阻斷下游通路，并通過激活caspase通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究首次發(fā)現(xiàn)，沉默-可引起CRC細(xì)胞對司美替尼化療耐藥，進一步證實了PD-L1除了發(fā)揮免疫檢查點的功能外，還可通過其自身的表達(dá)水平影響CRC的化療敏感性。

MCL-1是Bcl-2家族中重要的抗凋亡蛋白，主要通過與相關(guān)蛋白相互作用參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。經(jīng)典的線粒體途徑凋亡中，腫瘤細(xì)胞在外部刺激下可通過多個信號通路激活Bim蛋白，活化的Bim蛋白從微管蛋白復(fù)合體上釋放，移位于線粒體膜，活化BAK/BAX促凋亡因子，使得寡聚化的BAX/BAK插入線粒體外膜，導(dǎo)致其通透性改變并釋放細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子1形成凋亡小體，凋亡小體與凋亡蛋白caspase作用并進一步激活caspases級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。正常情況下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡蛋白MCL-1通過與Bim蛋白結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，但在某些藥物的作用下，MCL-1與Bim蛋白的結(jié)合力下降并促進Bim的釋放，進而激活線粒體途徑凋亡信號通路促進細(xì)胞凋亡［17］，研究證實，MCL-1與多個腫瘤的化療耐藥相關(guān)。在乳腺癌中，MCL-1的過表達(dá)與化療耐藥明顯相關(guān)［18］。在胰腺癌中，MCL-1與細(xì)胞對吉西他濱化療耐藥相關(guān)，沉默-可顯著增加細(xì)胞對吉西他濱的化療敏感性［19］。在卵巢癌中，MCL-1與細(xì)胞對卡鉑化療耐藥明顯相關(guān)［20］。因此，MCL-1在腫瘤的化療耐藥中發(fā)揮重要作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)，無論PD-L1的表達(dá)水平如何，沉默-或聯(lián)合使用AZD5991均可顯著增加CRC細(xì)胞對司美替尼的化療敏感性，并可逆轉(zhuǎn)-敲除引起的對司美替尼化療敏感性下降，這對于PD-L1表達(dá)陰性的CRC患者提高對司美替尼化療敏感性有著重要的臨床指導(dǎo)價值。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)沉默-可引起CRC細(xì)胞對司美替尼化療敏感性下降，沉默-或者聯(lián)合使用AZD5991均可逆轉(zhuǎn)-敲除引起的CRC細(xì)胞對司美替尼化療敏感性下降。PD-L1/MCL-1影響CRC細(xì)胞司美替尼化療敏感性的分子機制尚待進一步明確。目前，MEK抑制劑已應(yīng)用于V600E突變型CRC的三線姑息治療，鑒于CRC組織中PD-L1的低表達(dá)率，MEK抑制劑聯(lián)合MCL-1抑制劑有可能成為部分CRC患者新的治療策略。

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Inhibition of MCL-1 reverses poor chemosensitivity of colorectal cancer cells to selumetinib induced by-knockout

SUN Lei， HONG Chu-yuan， YIN Xue-xia， GUO Xiong-bo， ZHANG Shi， ZHONG Bei-ping， WANG Guo-qiang△

（，510260，）

To determine the effects and mechanism of programmed death ligand-1-on chemosensitivity to selumetinib in colorectal cancer （CRC） cells.After human colon carcinoma RKO cells and-knockout RKO cells were treated with selumetinib， cleaved caspase-3 （C-Casp-3） protein level was detected by Western blot， and the apoptosis rate and cell survival rate were tested by flow cytometry （FCM） and colony formation assay， respectively. The RKO and-knockout RKO cells were treated with selumetinib after myeloid cell leukemia-1（-） knockdown， or co-treated with selumetinib and AZD5991， C-Casp-3 protein level was detected by Western blot， and the apoptosis rate and cell survival rate were tested by FCM and colony formation assay， respectively. After mouse colon adenocarcinoma MC38 cells and-knockout MC38 cells were co-treated with selumetinib and AZD5991， C-Casp-3 protein level was detected by Western blot， and the apoptosis rate and cell survival rate were tested by FCM and colony formation assay， respectively.Western blot showed that selumetinib significantly decreased phosphorylated extracellular signal-regulated kinase （p-ERK） protein level. Knockout of-significantly reduced selumetinib-induced C-Casp-3 protein level.-shRNA or co-treatment with AZD5991 significantly increased selumetinib-induced C-Casp-3 protein level. The FCM results showed that knockout of-significantly reduced the apoptosis induced by selumetinib， and-shRNA or co-treatment with AZD5991 significantly increased apoptosis induced by selumetinib. Colony formation assay showed that knockout of-significantly increased cell survival rate after treatment with low concentration of selumetinib， and-shRNA or co-treatment with AZD5991 significantly reduced cell survival rate. More importantly，-shRNA or co-treatment with AZD5991 eliminated the differences in C-Casp-3， apoptosis and cell survival rate caused by-knockout.Knockout of-decreases the chemosensitivity of CRC cells to selumetinib. Both genetic and pharmaceutical inhibition of MCL-1 reverses poor chemosensitivity of CRC cells to selumetinib induced by-knockout.

Myeloid cell leukemia-1； Programmed death ligand-1； Selumetinib； Colorectal cancer； Chemosensitivity

R363； R73-36； R735.3+5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.007

1000-4718（2022）06-1008-07

2021-11-25

2022-01-25

廣州市屬高校科研項目（No.1201630159）；廣州市科技計劃市校聯(lián)合項目（No.202102010062）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院精英人才配套項目（No. 010M07060）

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（責(zé)任編輯：余小慧，李淑媛）