萬林峰，袁志軍，陳 虎

宜春市人民醫(yī)院藥學(xué)部，江西宜春 336000

心力衰竭(heart failure，HF)是由心臟結(jié)構(gòu)或功能異常引起的復(fù)雜的臨床綜合征，幾乎所有的心血管疾病最終都會導(dǎo)致HF的發(fā)生。HF影響全球2600多萬人，由于其高死亡率、高發(fā)病率和高醫(yī)療費用，HF仍然是世界公共衛(wèi)生的主要負(fù)擔(dān)之一[1]。HF的發(fā)病率隨著年齡的增長而急劇上升，其主要病因是冠心病、心臟瓣膜異常和高血壓[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、利尿劑、β-腎上腺素受體阻斷劑、血管緊張素受體Ⅰ拮抗劑和正性肌力藥物是目前治療HF的主要方案。然而，長期使用這些藥物會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如電解質(zhì)紊亂、體液不足和低血壓等[3]。因此，需要開發(fā)新的抗HF藥物。茶多酚是綠茶的主要生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、降低血壓、抗癌等多種作用[4]。已有研究表明，茶多酚會觸發(fā)鈉/鉀-腺苷三磷酸酶/肉瘤基因受體，激活強(qiáng)心甾類固醇樣信號通路，并提供蛋白激酶C依賴性的保護(hù)，防止大鼠心臟缺血/再灌注損傷[5]。目前，茶多酚對HF的作用及其機(jī)制尚不明確。現(xiàn)有證據(jù)顯示，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的過度激活導(dǎo)致HF時內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[6]。因此，抑制RAAS的過度激活可能是改善HF的一個潛在治療策略。以往的研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smads通路參與了心臟的病理重塑，這種重塑是通過誘導(dǎo)間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞肥大，導(dǎo)致膠原過度堆積和細(xì)胞外基質(zhì)沉積來響應(yīng)壓力超負(fù)荷而發(fā)生的[7]。而抑制TGF-β1的表達(dá)對預(yù)防心肌纖維化具有潛在價值。因此，本研究旨在探究茶多酚是否通過調(diào)節(jié)RAAS和TGF-β1/Smads信號通路的過度激活在HF大鼠中發(fā)揮保護(hù)作用，以期為明確茶多酚對HF的作用機(jī)制及開發(fā)新的HF治療策略提供科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

材料茶多酚(純度≥98.0%，批號84650-60-2)購自北京索萊寶科技有限公司，卡托普利(國藥準(zhǔn)字H31020617)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，血漿腎素活性(plasma renin activity，PRA)ELISA檢測試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司，Masson三色染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)、醛固酮(aldosterone，ALD)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，TGF-β1抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司，Ⅰ型和Ⅲ型膠原、磷酸化Smad(phosphorylated Smad，p-Smad)2和Smad2抗體購自英國Abcam公司，p-Smad3和Smad3抗體購自美國GeneTex公司，GAPDH抗體購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

動物分組與建模SPF級健康雄性SD大鼠32只，6～7周齡，體重180～200 g，飼養(yǎng)于SPF級動物實驗房，環(huán)境溫度(23±2)℃、濕度50%～60%、光照/黑暗周期為12 h，自由進(jìn)食和飲水。所有大鼠適應(yīng)環(huán)境一周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)、卡托普利治療組(PC組)和茶多酚治療組(TP組)，每組8只。除Sham組外，其余各組采用絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支法建立心肌梗死后HF大鼠模型[8]。大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后，連接心電圖，用自動呼吸機(jī)(潮氣量10～12 ml，呼吸頻率90次/min，呼吸比1∶2)插管通氣。暴露大鼠心臟、主動脈和肺動脈，6-0絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，可見左心室前壁部分心肌變蒼白，室壁運(yùn)動減弱，心電圖Ⅰ、Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高。Sham組大鼠進(jìn)行相同手術(shù)操作，但不結(jié)扎血管。所有大鼠逐層縫合傷口。術(shù)后2周，超聲心動圖測定大鼠射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)，當(dāng)EF<55%時，即為HF模型建模成功。隨后，所有大鼠每天給藥1次，連續(xù)給藥8周，其中，PC組灌胃卡托普利5 mg/kg[9]，TP組灌胃茶多酚100 mg/kg[10]，其余組灌胃等量生理鹽水。

超聲心動圖所有大鼠末次給藥24 h后，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后，行超聲心動圖檢查大鼠心功能情況，檢測指標(biāo)包括：左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVEDs)、EF和左心室短軸縮短率(left ventricular short axis shortening rate，LVFS)。

心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)所有大鼠末次給藥24 h后，稱量大鼠體重。10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后，取各組大鼠心臟，并稱其重量。根據(jù)公式，計算以下指標(biāo)：心臟質(zhì)量指數(shù)(heart mass index，HMI)=心臟質(zhì)量/體重；左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)=左心室質(zhì)量/體重。

HE染色心臟稱重后，10%福爾馬林固定組織24 h。梯度酒精脫水，二甲苯透明。將已透明的組織塊置于融化的石蠟中，待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。切片放入蘇木素染液中染色3 min，自來水沖洗；1%鹽酸酒精分化3 s，自來水沖洗；0.6%氨水返藍(lán)，自來水沖洗；伊紅染液中染色1 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明；滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片封固，顯微鏡下觀察拍照。

Masson染色根據(jù)Masson三色染色試劑盒說明書所示，進(jìn)行實驗操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。用配制好的鐵蘇木素染液染色10 min；鹽酸乙醇分化液分化、水洗；氨水水溶液返藍(lán)，水洗；去離子水洗1 min；麗春紅酸性品紅染色液染色5 min；乙酸水溶液洗1 min；磷鉬酸水溶液洗2 min，乙酸水溶液洗1 min；苯胺藍(lán)染色液染色2 min，乙酸水溶液洗1 min。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。染色結(jié)果中，細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞質(zhì)呈紅色，膠原蛋白呈藍(lán)色。Image Pro Plus 6.0軟件分析心肌纖維化程度。

免疫組織化學(xué)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓法進(jìn)行組織抗原修復(fù)。內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(3%過氧化氫)室溫孵育5 min。滴加10%牛血清白蛋白封閉液，37 ℃條件下封閉1 h。Ⅰ型膠原抗體(1∶200)和Ⅲ型膠原抗體(1∶200)4 ℃條件下孵育過夜。二抗(1∶500)37 ℃條件下孵育1 h。切片經(jīng)清洗后，加入DAB顯色劑，室溫顯色5 min。自來水終止顯色。蘇木素染液染色40 s，水洗1 min。1%鹽酸酒精分化3 s。切片梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。Image Pro Plus 6.0軟件分析心?、裥秃廷笮湍z原的表達(dá)。

ELISA檢測所有大鼠末次給藥24 h后，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后，腹主動脈取血。血液室溫靜置20 min后，3000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃條件下保存。按照ELISA試劑盒說明書所示，檢測各組大鼠血清中AngⅡ、ALD、PRA、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

Western blot檢測取大鼠心臟組織，充分剪碎后加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min。離心收集所得上清液，BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度。各組樣品分別取30 μg蛋白加入上樣孔中，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入TGF-β1(1∶1000)、p-Smad2(1∶1000)、Smad2(1∶1000)、p-Smad3(1∶1000)、Smad3(1∶1000)和GAPDH(1∶5000)抗體，置于4 ℃條件下孵育過夜。二抗(1∶5000)室溫條件下孵育1 h。滴加ECL超敏化學(xué)發(fā)光液至膜上，暗室曝光，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度分析。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

心功能指標(biāo)變化Sham組大鼠心臟超聲表現(xiàn)正常，波形明顯且穩(wěn)定；Model組超聲表現(xiàn)異常，波形消失；PC組和TP組超聲波形逐漸恢復(fù)(圖1)。與Sham組比較，Model組大鼠LVEDd[(4.99±0.31)mm比(3.83±0.23)mm；t=8.473，P=0.003]和LVEDs[(4.42±0.37)mm比(3.15±0.18)mm；t=6.256，P=0.002]明顯升高，而EF[(40.31±7.85)%比(74.74±3.35)%；t=13.174，P=0.002]和LVFS[(21.15±4.55)%比(45.01±3.07)%；t=11.853，P=0.001]則明顯降低；與Model組比較，PC組和TP組大鼠LVEDd[(4.08±0.25)mm比(4.99±0.31)mm；t=6.367，P=0.003和(4.25±0.23)mm比(4.99±0.31)mm；t=5.264，P=0.003]和LVEDs[(3.56±0.21)mm比(4.42±0.37)mm；t=5.253，P=0.002和(3.64±0.25)mm比(4.42±0.37)mm；t=5.974，P=0.001]明顯降低，而EF[(59.96±8.64)%比(40.31±7.85)%；t=11.264，P=0.002和(57.33±7.09)%比(40.31±7.85)%；t=10.356，P=0.001]和LVFS[(33.64±4.32)%比(21.15±4.55)%；t=8.246，P=0.002和(31.63±4.57)%比(21.15±4.55)%；t=7.824，P=0.001]則明顯升高。

HMI和LVMI比較Sham組、Model組、PC組、TP組的HMI分別為(2.64±0.22)、(3.55±0.31)、(2.69±0.21)、(2.89±0.32)mg/g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.245，P=0.011)；LVMI分別為(1.86±0.13)、(2.37±0.28)、(1.91±0.11)、(1.92±0.15)mg/g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.245，P=0.011)。與Sham組比較，Model組大鼠HMI(t=5.246，P=0.009)和LVMI(t=6.235，P=0.008)明顯升高；與Model組比較，PC組和TP組大鼠HMI(t=5.012，P=0.007；t=4.953，P=0.005)和LVMI(t=5.531，P=0.003；t=5.483，P=0.004)明顯降低。

心肌病理變化HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、排列緊密有序，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，無明顯損傷，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；Model組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，間隙增寬，肌纖維間疏松水腫，并伴有明顯的炎性細(xì)胞浸潤；PC組和TP組大鼠心肌細(xì)胞排列與Model組比較趨于整齊(圖2)。

圖2 HE染色檢測各組大鼠心肌病理變化(×200)

細(xì)胞外基質(zhì)重塑變化與Sham組比較，Model組大鼠心肌纖維化程度[(24.23±4.38)%比(6.58±0.71)%；t=9.748，P=0.001]明顯升高，Ⅰ型膠原[(16.43±2.11)%比(2.61±0.29)%；t=11.754，P=0.001]和Ⅲ型膠原[(17.23±2.18)%比(3.12±0.46)%；t=10.573，P=0.001]表達(dá)也明顯增加；與Model組比較，PC組和TP組大鼠心肌纖維化程度[(13.56±1.52)%比(24.23±4.38)%；t=6.734，P=0.001和(16.69±1.88)%比(24.23±4.38)%；t=5.362，P=0.001]明顯降低(圖3)，Ⅰ型膠原[(7.16±0.84)%比(16.43±2.11)%；t=5.373，P=0.001和(9.28±1.05)%比(16.43±2.11)%；t=4.364，P=0.001]和Ⅲ型膠原[(6.75±0.83)%比(17.23±2.18)%；t=6.764，P=0.001和(9.22±1.03)%比(17.23±2.18)%；t=4.579，P=0.001]表達(dá)也明顯減少(圖4)。

圖3 Masson染色檢測各組大鼠心肌纖維化(×200)

圖4 免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)(×200)

RAAS和炎癥指標(biāo)水平變化與Sham組比較，Model組大鼠血清中AngⅡ[(2.93±0.34)ng/ml比(1.68±0.22)ng/ml；t=4.246，P=0.001]、ALD[(184.92±21.09)pg/ml比(116.87±13.51)pg/ml；t=5.385，P=0.004]、PRA[(3.94±0.36)ng/ml比(2.73±0.29)ng/ml；t=4.386，P=0.004]水平明顯升高，IL-1β[(0.37±0.04)ng/ml比(0.18±0.02)ng/ml；t=4.393，P=0.001]、IL-6[(153.53±14.30)pg/ml比(96.37±9.86)pg/ml；t=6.375，P=0.002]和TNF-α[(118.86±12.52)pg/ml比(71.23±6.83)pg/ml；t=4.753，P=0.002]水平也明顯升高；與Model組比較，PC組和TP組大鼠血清中AngⅡ[(1.87±0.19)ng/ml比(2.93±0.34)ng/ml；t=3.126，P=0.001和(2.06±0.25)ng/ml比(2.93±0.34)ng/ml；t=2.853，P=0.001]、ALD[(128.64±13.26)pg/ml比(184.92±21.09)pg/ml；t=3.854，P=0.004和(147.35±15.46)pg/ml比(184.92±21.09)pg/ml；t=3.164，P=0.004]和PRA[(3.11±0.27)ng/ml比(3.94±0.36)ng/ml；t=3.126，P=0.004和(3.22±0.26)ng/ml比(3.94±0.36)ng/ml；t=3.063，P=0.004]水平明顯降低，IL-1β[(0.23±0.03)ng/ml比(0.37±0.04)ng/ml；t=2.964，P=0.001和(0.28±0.02)ng/ml比(0.37±0.04)ng/ml；t=2.765，P=0.001]、IL-6[(114.02±12.55)pg/ml比(153.53±14.30)pg/ml；t=4.865，P=0.002和(120.33±11.49)pg/ml比(153.53±14.30)pg/ml；t=4.275，P=0.002]和TNF-α[(85.34±9.05)pg/ml比(118.86±12.52)pg/ml；t=3.146，P=0.002和(93.63±8.56)pg/ml比(118.86±12.52)pg/ml；t=2.973，P=0.002]水平也明顯降低。

TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白表達(dá)與Sham組比較，Model組大鼠TGF-β1(0.56±0.06比0.13±0.01；t=6.365，P=0.001)、p-Smad2/Smad2(1.12±0.13比0.15±0.01；t=13.755，P=0.001)和p-Smad3/Smad3(1.36±0.15比0.18±0.01；t=11.657，P=0.002)蛋白表達(dá)水平均明顯升高；與Model組比較，PC組和TP組大鼠TGF-β1(0.23±0.02比0.13±0.01；t=4.657，P=0.001和0.27±0.03比0.13±0.01；t=4.176，P=0.001)、p-Smad2/Smad2(0.25±0.02比1.12±0.13；t=9.687，P=0.001和0.48±0.05比1.12±0.13；t=6.753，P=0.001)和p-Smad3/Smad3(0.78±0.07比1.36±0.15；t=6.477，P=0.002和0.83±0.09比1.36±0.15；t=4.754，P=0.002)蛋白表達(dá)水平均明顯降低(圖5)。

Mr：相對分子質(zhì)量；1：假手術(shù)組；2：模型組；3：PC組；4：TP組；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1

討 論

HF是由心臟結(jié)構(gòu)或功能異常引起的心室射血或充盈障礙的復(fù)雜臨床綜合征。HF不僅患病率高，而且預(yù)后差，已成為老年人死亡的主要原因之一[11]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為左心室的病理性重構(gòu)是HF發(fā)生的最重要的病理生理機(jī)制。心功能減退和左室肥厚是左室重構(gòu)的主要表現(xiàn)[12]。目前臨床上對HF的治療，一般是在擴(kuò)張血管、心搏驟停、利尿等對癥治療的基礎(chǔ)上，采用β-受體阻滯劑和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑來抑制HF時的神經(jīng)內(nèi)分泌激活，從而延緩和預(yù)防心肌重構(gòu)，降低患者的住院率和死亡率。但總的來說，治療HF的總體療效并不理想[13]。

綠茶的主要功能成分是類黃酮、氨基酸和多糖。作為茶葉中的主要黃酮類化合物，TP占茶葉干重的30%[14]。TP在預(yù)防癌癥、糖尿病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要的作用[15]。長期服用綠茶提取物可對正常心臟產(chǎn)生積極作用，提高能量利用率，改善正常心肌細(xì)胞的力學(xué)性能和細(xì)胞內(nèi)鈣動態(tài)[16]。TP對糖尿病心肌病具有突出的治療作用，TP治療可明顯改善糖尿病心肌病大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能，改善大鼠心肌病理變化[17]。此外，TP對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，TP治療可改善大鼠心功能。在缺血再灌注早期，TP通過改善心肌能量代謝，抑制心肌細(xì)胞緩慢鈣內(nèi)流，從而起到一定的保護(hù)作用[18]。本研究結(jié)果顯示，TP治療可顯著改善HF大鼠心功能，抑制左心室肥厚。此外，TP治療可明顯抑制HF大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高。本研究結(jié)果表明，TP可改善心肌梗死后HF，在HF中發(fā)揮抗炎作用。

RAAS是調(diào)節(jié)血管張力、血容量和心血管功能的中樞系統(tǒng)，與疾病進(jìn)展密切相關(guān)[19]。RAAS的慢性激活可促進(jìn)和維持HF，在HF的發(fā)病機(jī)制中也起著不可或缺的作用[20]。研究證實，RAAS的主要成分AngⅡ、ALD和PRA在HF患者中顯著增加[21]。此外，臨床試驗表明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可以減緩HF的發(fā)展，降低心血管疾病的發(fā)病率和死亡率[22]。當(dāng)RAAS在心肌梗死中被激活時，組織中AngⅡ和ALD含量會升高，并且伴隨組織纖維化和組織炎癥加重，這可能導(dǎo)致左心室功能障礙、心室重構(gòu)和心肌細(xì)胞壞死，從而進(jìn)一步加速HF的發(fā)展[23]。本研究結(jié)果顯示，HF大鼠血清中AngⅡ、ALD和PRA水平明顯升高，IL-1β、IL-6和TNF-α水平也明顯升高，而TP治療可明顯抑制HF大鼠AngⅡ、ALD、PRA、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。本研究結(jié)果表明，TP可能通過抑制RAAS的過度激活和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在HF中發(fā)揮保護(hù)作用。

TGF-β1是心室重構(gòu)的重要調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)心肌生長、肌成纖維細(xì)胞激活和細(xì)胞外基質(zhì)生成參與心肌纖維化過程[24]。此外，Smad2和Smad3作為TGF-β1的重要下游信號，在TGF-β1誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化過程中起著至關(guān)重要的作用，對組織纖維化具有重要促進(jìn)作用[25]。磷酸化后Smad2/3可與Smad4結(jié)合形成參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)合物，從而促進(jìn)膠原的表達(dá)，促進(jìn)心肌纖維化的形成和發(fā)展。而抑制TGF-β1/Smads 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可明顯抑制心肌纖維化過程[26]。本研究結(jié)果顯示，HF大鼠心肌中TGF-β1表達(dá)、Smad2和Smad3磷酸化水平均明顯升高。此外，HF大鼠心臟纖維化程度、Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)均明顯升高。而TP治療可抑制TGF-β1表達(dá)、Smad2和Smad3磷酸化水平，改善HF大鼠心臟纖維化程度，降低Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)。本研究結(jié)果表明，TP可能通過抑制TGF-β1/Smads 通路的激活，抑制HF大鼠心肌纖維化過程，從而在HF中發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上，本研究結(jié)果顯示，TP可能通過抑制RAAS和TGF-β1/Smads 通路的激活，抑制HF大鼠炎癥反應(yīng)的發(fā)生和心肌纖維化過程，從而在HF中發(fā)揮保護(hù)作用。研究成果為明確TP在HF中的作用機(jī)制及開發(fā)新的HF治療策略提供了科學(xué)依據(jù)。