林永 李麗 劉琦 閆東升

作者單位：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 省部共建眼視光學(xué)和視覺(jué)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325027

葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一種成人最常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤，多發(fā)于40～60 歲，多見(jiàn)于眼的脈絡(luò)膜后極部，起源于眼內(nèi)葡萄膜黑色素細(xì)胞。目前主要治療手段有激光、局部放療和局部切除術(shù)聯(lián)合藥物治療，嚴(yán)重時(shí)需行眼球摘除術(shù)。50% UM患者會(huì)發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后致死率極高，目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控參與葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展，包括DNA甲基化、RNA甲基化、非編碼RNA和組蛋白乙?；揎椀?。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1（Silent information regulator protein 1，SIRT1）是第III類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的組蛋白去乙?；福ㄟ^(guò)去乙?；M蛋白或非組蛋白底物調(diào)節(jié)細(xì)胞的不同生物學(xué)行為，包括細(xì)胞周期、遷移、凋亡、代謝和自噬等方面。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著非常復(fù)雜的作用，SIRT1能促進(jìn)一些腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等。除此之外，SIRT1高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致卵巢癌、肺癌等腫瘤對(duì)化療產(chǎn)生一定的抵抗性，從而影響治療效果，故SIRT1被稱為促癌因子。但也有一些研究表明SIRT1可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如胃癌、口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌等，但其在葡萄膜黑色素瘤中的調(diào)控機(jī)制尚未明了。

本研究通過(guò)檢測(cè)SIRT1在正常葡萄膜黑色素細(xì)胞和葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討抑制SIRT1活性或表達(dá)后對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖及相關(guān)蛋白和信號(hào)通路的影響，為葡萄膜黑色素瘤的臨床治療提供新的策略和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞M23 由美國(guó)紐約醫(yī)學(xué)院胡誕寧教授惠贈(zèng)；人眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5、人眼葡萄膜黑色素細(xì)胞DM78由加拿大魁北克免疫學(xué)研究中心提供；人眼葡萄膜黑色素細(xì)胞UM95、UM96由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)6周雌性裸鼠12只，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)和使用遵循溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的規(guī)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素/鏈霉素和Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)GIBICO公司。0.05%胰酶、小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。MTS細(xì)胞增殖分析試劑購(gòu)于美國(guó)Promega公司，抗體E2啟動(dòng)子結(jié)合因子1（Adenovirus E2 factor-1，E2F1）、磷酸化視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因（Phospho-Retinoblastoma gene，p-RB）、周期素D2（CYCLIND2）、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，P21）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Phospho-Serine Threonine kinase，p-AKT）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Serine Threonine kinase，AKT），β-肌動(dòng)蛋白（β-ACTIN，）均購(gòu)于美國(guó)cell signal technology公司。硝酸纖維素膜購(gòu)于德國(guó)GE Healthcare公司。實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司，SpectraMax M5 酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Molecular Devices 公司，IVIS?Lumina III 活體成像儀購(gòu)于美國(guó)Lumina公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO,用0.05%胰酶消化并以1:4～1:8傳代，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 藥物處理 EX527用DMSO溶解，用培養(yǎng)基稀釋成1、2.5、5、10、25 μmol/L(μM)作用于M23和SP6.5作為實(shí)驗(yàn)組，以含有溶劑DMSO的培養(yǎng)基處理作為陰性對(duì)照。根據(jù)MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用5 μM。

1.4.3 siRNA轉(zhuǎn)染 將M23、SP6.5接種在12孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到30%～40%，將2 μl lipo RNAiMAX和6 μL siRNA 稀釋在250 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基中，室溫靜置15 min后加入細(xì)胞中。siRNA序列如下：siNC：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3’；siSIRT1：5’-GAA GTT GAC CTC CTC ATT GT-3’。

1.4.4 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的M23和SP6.5細(xì)胞，按照每孔5×103細(xì)胞數(shù)量接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的EX527或者進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，作用48 h后每孔加入15 μl的MTS和85 μl F12培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱避光繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下讀取各孔的光密度值（Optical density，OD）。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 使用Cycle test plus試劑盒（Becton Dickinson）檢測(cè)，細(xì)胞接種在6 孔板中，EX527處理或siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，用0.05%胰酶消化細(xì)胞，血清中和之后進(jìn)行碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色，用細(xì)胞流式儀分析細(xì)胞周期分布。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將M23、SP6.5細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種3000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)1周后，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，1% 結(jié)晶紫染色液染色10 min。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.7 眼內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 6周齡雌性裸鼠分成siSIRT1和NC兩組，每組6只。SP6.5分別轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA或者NC，24 h后收集細(xì)胞，用0.9%氯化鈉溶液稀釋成濃度為1×105 個(gè)細(xì)胞/μl，裸鼠右眼前房注射SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組或者NC siRNA 轉(zhuǎn)染組SP6.5細(xì)胞2 μl。每周補(bǔ)注射SIRT1或者NC siRNA，3周后使用活體成像儀觀察眼內(nèi)腫瘤形成情況，進(jìn)行活體生物熒光成像分析。

1.4.8 Western blot法 蛋白裂解液RIPA（含蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞后，離心取上清，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，變性，取20 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉液封閉，一抗孵育過(guò)夜，熒光二抗室溫孵育1 h，曝光獲得目的蛋白條帶。用Image J軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值?？贵w名稱及稀釋濃度如下：E2F1（1:1000）、p-RB（1:1000）、CYCLIN D2（1:1000）、P21（1:1000）、p-AKT（1:1000）、AKT（1:1000）、SIRT1（1：1000），β-ACTIN（1:1000）作為內(nèi)參。

1.4.9 RNA收集和定量PCR 用Trizol法提取葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞（M23和SP6.5）和正常人葡萄膜黑色素細(xì)胞（DM78、UM95和UM96）中RNA，測(cè)量濃度后，取RNA 1 μg，在20 μl 逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，以1 μl cDNA 為模板加入靶基因上下游引物，在20 μl 體系中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。用ACTB作為內(nèi)參，用2法定量分析基因表達(dá)水平。引物：SIRT1-forward:5’-TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3’;SIRT1-reverse:5’-ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3’;ACTB-forward:5’-GAT CAT TGC TCC TCC TGA GC-3’;ACTB-reverse:5’-ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC-3’.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且方差齊，以表示。組間比較采用獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)。以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)

定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示M23 和SP6.5 細(xì)胞中SIRT1 mRNA表達(dá)顯著增高（

t

=17.08，

P

＜0.001；

t

=13.24，

P

＜0.001），Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)M23 和SP6.5 細(xì)胞中SIRT1 蛋白水平也顯著增高（

t

=6.26，

P

=0.008），見(jiàn)圖1。

圖1.正常葡萄膜黑色素細(xì)胞和葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況A：定量PCR檢測(cè)SIRT1 mRNA在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞（M23、SP6.5）和葡萄膜黑色素細(xì)胞（DM78、UM95、UM96）中的表達(dá)，b P＜0.01；B：Western blot檢測(cè)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞（M23、SP6.5）和葡萄膜黑色素細(xì)胞（DM78、UM95、UM96）中SIRT1蛋白表達(dá)情況，β-ACTIN為內(nèi)參Figure 1.The expression levels of SIRT1 in uveal melanocytes and uveal melanoma cells.A:Quantitative RT-PCR analysis of SIRT1 mRNA in the three melanocytes (DM78,UM95 and UM96) and the two UM cells (M23 and SP6.5),b P＜0.01.B:Western blot detected the protein expression of SIRT1 in the UM cells (M23,SP6.5) and the control melanocytes (DM78,UM95 and UM96).β-ACTIN was used as an endogenous control.

2.2 SIRT1對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞活性的影響

將SIRT1 抑制劑EX527 濃度設(shè)置成1、2.5、5、10、25 μmol/L，DMSO溶劑作為對(duì)照，作用于M23、SP6.5 48 h后，與DMSO組相比，細(xì)胞在5 μmol/L時(shí)活力開(kāi)始明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=9.15,

P

＜0.001;

t

=4.56,

P

=0.002），并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，見(jiàn)圖2A。SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染M23和SP6.5 48 h后檢測(cè)細(xì)胞活性，與NC轉(zhuǎn)染組相比，siSIRT1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活性受到明顯的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=5.94,

P

＜0.001;

t

=10.73,

P

＜0.001），見(jiàn)圖2B。

圖2.SIRT1對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞活性的影響A：不同濃度梯度EX527作用于M23和SP6.5 48 h后，對(duì)細(xì)胞活性的影響；B：SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后對(duì)M23和SP6.5細(xì)胞活性的影響。M23和SP6.5：人葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞;NC，無(wú)義siRNA轉(zhuǎn)染；siSIRT1，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染Figure 2.The effect of SIRT1 on the viability of uveal melanoma cells.A:The cytotoxic effect of concentration gradients of EX527 on UM cells for 48 h.B:The effect of SIRT1 siRNA transfection on UM cell viability.M23 and SP6.5:Human uveal melanoma cell lines;NC:negative control siRNA transfection;siSIRT1:SIRT1 siRNA transfection group.

2.3 SIRT1對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞周期的影響

為了進(jìn)一步探討SIRT1 對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞周期的影響，用5 μmol/L EX527 和SIRT1 siRNA處理M23和SP6.5 48 h，與DMSO處理組相比，EX527 處理組中處于G1 期細(xì)胞數(shù)量明顯增多[（56.92±1.15）%

vs.

64.09±0.80）%；（50.7±1.23）%

vs.

（76.79±3.21）%]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

t

=5.10，

P

=0.047;

t

=7.57,

P

=0.002），見(jiàn)圖3A—B。和NC組相比，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組中處于G1 期細(xì)胞數(shù)量也顯著增加[（52.25±1.37）%

vs.

（66.61±1.77）%；（52.25±1.37）%

vs.

（67.72±2.10）%]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=6.41,

P

=0.003,

t

=6.10,

P

=0.004），見(jiàn)圖3C—D。以上結(jié)果提示下調(diào)SIRT1活性或表達(dá)導(dǎo)致葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞G1期阻滯。

圖3.SIRT1對(duì)人葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞周期的影響A：流式細(xì)胞術(shù)分析EX527處理M23和SP6.5細(xì)胞周期分布；B：M23、SP6.5細(xì)胞處于G1、G2、S期統(tǒng)計(jì)圖；C：流式細(xì)胞術(shù)分析SIRT1和NC siRNA轉(zhuǎn)染后M23和SP6.5細(xì)胞周期分布；D：M23、SP6.5細(xì)胞處于G1、G2、S期統(tǒng)計(jì)圖。aP＜0.05;bP＜0.01。M23和SP6.5：人葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞Figure 3.The effect of SIRT1 on the cycle distribution of uveal melanoma cells.A:Effect of EX527 on cell cycle distribution in uveal melanoma cells (M23,SP6.5) analyzed by flow cytometry.B:Statistical histograms of cell distribution in stages G1,G2,and S of uveal melanoma cells.C:Effect of SIRT1 siRNA on cell cycle distribution in uveal melanoma cells (M23,SP6.5) analyzed by flow cytometry.D:Statistical histograms of cell distribution in stages G1,G2,and S.aP＜0.05;bP＜0.01.M23 and SP6.5:Human uveal melanoma cells lines.

2.4 SIRT1 對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖能力的重要手段。結(jié)果顯示，用EX527和SIRT1 siRNA處理M23和SP6.5后，與DMSO組相比，EX527處理組細(xì)胞克隆形成斑明顯減小，數(shù)目分別減少了（30.10±2.06）%和（25.77±3.54）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=5.04,

P

=0.001;

t

=5.93,

P

＜0.001）；與NC組比較，siSIRT1 轉(zhuǎn)染組克隆形成斑也明顯減小，數(shù)目也顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=11.44,

P

＜0.001;

t

=8.24,

P

＜0.001），見(jiàn)圖4。以上結(jié)果提示抑制SIRT1的活性或表達(dá)可以明顯抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的克隆形成能力。

圖4.SIRT1對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響與陰性對(duì)照組相比，EX527處理組和siSIRT1轉(zhuǎn)染組抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的克隆形成。DMSO：DMSO處理對(duì)照組；EX527：5 μmol/L EX527處理組；NC：陰性轉(zhuǎn)染組；siSIRT1：SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組；M23和SP6.5：人葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞Figure 4.The effect of SIRT1 on the colony formation ability of uveal melanoma cells.Compared with the negative control group,the EX527 and SIRT1 siRNA transfected groups and markedly suppressed colony formation of uveal melanoma cells.DMSO:Cells were treated with DMSO;EX527:Cells were treated with 5 μmol/L EX527;NC:Negative control siRNA transfection;siSIRT1:SIRT1 siRNA transfected group;M23 and SP6.5:Human uveal melanoma cell lines.

2.5 SIRT1 對(duì)眼內(nèi)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞成瘤能力的影響

鑒于SIRT1 活性或表達(dá)的下調(diào)可以明顯抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖，本研究進(jìn)一步探討SIRT1對(duì)體內(nèi)葡萄膜黑色素瘤形成的影響，將轉(zhuǎn)染了SIRT1或者NC siRNA的SP6.5細(xì)胞注射到裸鼠的前房，3 周后觀察體內(nèi)成瘤情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA組的熒光強(qiáng)度顯著低于NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=5.50,

P

＜0.001），見(jiàn)圖5。以上數(shù)據(jù)提示SIRT1下調(diào)可以抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞在裸鼠眼內(nèi)生長(zhǎng)。

圖5.下調(diào)SIRT1表達(dá)對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞眼內(nèi)成瘤能力的影響與NC轉(zhuǎn)染組相比，SIRT1 siRNA組可明顯抑制人葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞眼內(nèi)腫瘤形成大小。NC：無(wú)義小干擾RNA轉(zhuǎn)染組。bP＜0.01Figure 5.The effect of SIRT1 knockdown on the tumor-genesis ability of uveal melanoma cells in vivo.SIRT1 siRNA transfection suppressed the tumor genesis of uveal melanoma cells compared to the NC-transfected group.NC:Negative control siRNA transfection.bP＜0.01

2.6 SIRT1 對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白和p-AKT的影響

如圖6 所示，EX527 處理或者siSIRT1 轉(zhuǎn)染48 h后收集蛋白，Western blot結(jié)果顯示，與DMSO處理組相比，EX527 處理組中P21（

t

=4.63,

P

=0.010;

t

=7.90,

P

=0.001）表達(dá)升高，E2F1（

t

=12.10,

P

=0.003;

t

=5.96,

P

=0.004）、CYCLIND2（

t

=36.28,

P

＜0.001;

t

=16.58,

P

＜0.001）、p-RB（

t

=17.55,

P

＜0.001;

t

=21.34,

P

＜0.001）表達(dá)都有不同程度降低，p-AKT在EX527 作用下表達(dá)也下調(diào)。與NC轉(zhuǎn)染組相比，siSIRT1 轉(zhuǎn)染組中，P21（

t

=5.88,

P

=0.004;

t

=10.51,

P

＜0.001）表達(dá)升高，E2F1（

t

=4.60,

P

=0.01;

t

=4.89,

P

=0.008）、CYCLIND2（

t

=5.13,

P

=0.007;

t

=5.63,

P

=0.005）、p-RB（

t

=4.45,

P

=0.011;

t

=6.53,

P

=0.003）、p-AKT（

t

=9.61,

P

＜0.001;

t

=6.44,

P

=0.003）表達(dá)也均下調(diào)。

圖6.SIRT1對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和p-AKT的影響A：SIRT1抑制劑EX527對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和p-AKT的影響；B：siSIRT1轉(zhuǎn)染對(duì)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和p-AKT的影響。p-AKT，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶；AKT，絲氨酸/蘇氨酸激酶；P21，細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A；CYCLIND2，周期素D2；E2F1，腺病毒E2啟動(dòng)子結(jié)合因子1；p-RB，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因；β-ACTIN為內(nèi)參Figure 6.The effect of SIRT1 on the expression of cell cycle-associated proteins and p-AKT in uveal melanoma cells.A:The effect of EX527 on the expression of cell cycle-associated proteins and p-AKT in uveal melanoma cells.B:The effect of SIRT1 siRNA transfection on the expression of cell cycle-associated proteins and p-AKT in uveal melanoma cells.p-AKT,Phospho-Serine Threonine kinase;AKT,Serine Threonine kinase;P21,cycle-dependent kinase inhibitor 1A;E2F1,adenovirus E2 factor-1;p-RB,phospho-retinoblastoma gene;β-ACTIN was used as the endogenous control.

3 討論

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控在葡萄膜黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮著重要的作用，如組蛋白H3K27Me3甲基化酶EZH2抑制劑DZNeP能明顯抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖。RNA甲基化酶METTL3 可以通過(guò)C-MET調(diào)控葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)與正常人葡萄膜黑色素細(xì)胞相比，組蛋白去乙?；窼IRT1在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)水平都升高，提示著SIRT1在UM發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。與本研究相似，近年有研究也發(fā)現(xiàn)SIRT1在多種腫瘤中表達(dá)都升高，如在結(jié)腸癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)上調(diào)，增加了結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲；在肝細(xì)胞癌中SIRT1 過(guò)表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、預(yù)后不良相關(guān)。故SIRT1也越來(lái)越受到研究人員的重視，有望成為治療腫瘤的新靶標(biāo)。

本研究采用SIRT1抑制劑EX527和小干擾RNA兩種方法分別抑制SIRT1的活性和蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)SIRT1 活性或表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期G1 期阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1 抑制劑EX527也可以抑制其他腫瘤的增殖，如EX527能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和的增殖。另外，EX527也能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。上述結(jié)果提示SIRT1抑制劑EX527 有望成為臨床治療葡萄膜黑色素瘤的潛在藥物。

細(xì)胞周期對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)揮著重要的作用，受到關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控，如周期素依賴性蛋白激酶（Cyclindependent kinases，CDK）、周期素（Cyclin）、P21以及p-Rb等。P21蛋白是一種周期素依賴蛋白激酶的抑制因子，能和Cdk4-CyclinD2復(fù)合物結(jié)合，抑制Rb的磷酸化，當(dāng)Rb處于低磷酸化時(shí)，其扣留著大量的轉(zhuǎn)錄因子E2F1，使它們不能發(fā)揮作用，從而阻斷細(xì)胞周期的行進(jìn)。本研究Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，下調(diào)SIRT1 活性或表達(dá)可以明顯上調(diào)P21 表達(dá)，下調(diào)p-Rb、E2F1和CyclinD2 的表達(dá)。可見(jiàn)，SIRT1 通過(guò)調(diào)控P21-CyclinD2-p-RB/E2F1一系列周期蛋白調(diào)控葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖。AKT，也稱蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB）是PI3K-AKT細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要蛋白，響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)，促進(jìn)代謝、增殖、細(xì)胞存活和血管生成，磷酸化AKT異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌等腫瘤中SIRT1通過(guò)調(diào)控p-AKT促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。本研究中，下調(diào)SIRT1活性或表達(dá)明顯抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中p-AKT表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖，盡管SIRT1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖可能存在其他調(diào)控機(jī)制，但其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用提示了SIRT1是葡萄膜黑色素瘤臨床治療的新靶標(biāo)。

綜合上述分析，下調(diào)SIRT1 的活性或蛋白表達(dá)抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖的活性，并抑制AKT信號(hào)通路。本研究揭示了SIRT1對(duì)葡萄膜黑色素瘤增殖有重要的調(diào)控作用，為臨床葡萄膜黑色素瘤的治療提供了新思維和新策略。

利益沖突申明

本研究無(wú)任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

林永：參與選題、設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)研究，收集數(shù)據(jù)，資料的分析和解釋；撰寫(xiě)論文；根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行修改。李麗、劉琦：參與實(shí)驗(yàn)研究，收集數(shù)據(jù)，資料的分析和解釋。閆東升：參與選題、設(shè)計(jì)、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行核修